自1997年香港Lo教授[1]等发现孕妇血浆中含有胎儿游离DNA(cell-free fetal DNA,ffDNA)后,无创产前DNA检测(noninvasive prenatal DNA testing,NIPT)技术逐步应用于产前筛查,该技术可以筛查18-三体和21-三体,还可筛查性染色体的非整倍体(sex chromosome aneuploidies,SCAs)。相对于传统的血清学筛查,NIPT在常染色体筛查中的灵敏度大于99%,假阳性率小于0.1%,所以阳性预测值(positive predictive value,PPV)较高。但有研究发现,NIPT对SCAs筛查的准确性较低[2],但之前的研究样本量较小,PPV的波动范围较大。本研究通过追踪分析NIPT检测的73 683例单胎孕妇中提示SCAs异常的175例孕妇及其胎儿的性染色体,探讨NIPT检测SCAs的准确性,为临床应用NIPT筛查SCAs提供参考。
对象与方法
1.研究对象:2019年1月至2022年7月于甘肃省妇幼保健院医学遗传中心行NIPT检测的单胎孕妇共73 683例,选择结果提示为性染色体高风险的175例孕妇及其胎儿作为研究对象,其中孕15～23+6周136人,孕24～26+6周39人,平均孕周(18.0±2.1)周。孕妇签署知情同意书后,采集孕妇外周血做性染色体荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)检测,并行羊水穿刺对胎儿进行产前诊断,孕18～23+6周行羊水细胞培养染色体核型分析,24周及以上者行FISH检测,对所有胎儿进行染色体拷贝数变异(copy number variations,CNVs)检测,并跟踪随访。
2.FISH检测:对NIPT提示胎儿SCAs高风险的所有孕妇进行性染色体FISH检测,采集外周静脉血2 mL,经过消化、固定、滴片、加探针杂交过夜、洗片及复染等过程,最后在荧光显微镜下观察。探针购自北京金菩嘉医疗科技有限公司,所有操作严格按照说明书进行。对孕周大于等于24周的孕妇加行羊水FISH检测。
3.羊水细胞培养及高通量CNVs检测:对孕18～23+6周的孕妇行羊膜腔穿刺术,取三管羊水于15 mL BD管中,两管用于羊水细胞培养,一管进行CNVs检测。羊水细胞经培养、收获、染片后,在显微镜下进行染色体核型分析。行CNVs检测的羊水先提取基因组DNA,然后构建文库,包括片段化-连接、聚合酶链反应(PCR)前纯化、PCR扩增、PCR后纯化等一系列操作,CNVs检测由Next Seq CN500高通量测序平台进行,由贝瑞基因Enliven®变异注释系统标注测序结果。
4.PPV定义:PPV是指真正患病的个体在筛查发现的阳性人群中所占的百分比[3],PPV越高筛查的准确性就越高。
结果
1.总体检测结果:在检测范围内共发现性染色体异常胎儿42例,其余133例胎儿性染色体未见明显异常。NIPT结果因母源因素提示SCAs高风险者共15人,仅1例胎儿性染色体异常,其余14例胎儿染色体未见明显异常,且均为46,XX;其他因素提示SCAs高风险者160人,发现胎儿性染色体异常共41例,其余119例胎儿性染色体未见明显异常,其中46,XX 83例,46,XY 36例。
(1)母源因素导致NIPT提示SCAs异常的结果:孕妇外周血FISH检测共发现性染色体异常者15例,占8.57%(15/175),其所孕育的胎儿性染色体异常者1例,占6.67%(1/15)。详细结果见表1。
表1 母源因素导致的胎儿SCAs的结果
数量(例)孕妇外周血FISH羊水培养结果CNV-seq结果1X0/XX嵌合45,X0[24]/46,XY[6]X0:XY=24:64XXX46,XXXX2XX/XXX嵌合46,XXXX8X0/XX嵌合46,XXXX
(2)除母源因素外NIPT提示SCAs异常的结果:160名性染色体FISH结果正常的孕妇中发现胎儿性染色体异常共41例,占25.63%(41/160),其中XXY 18例,XYY 5例,XXX 4例,X0 4例,X0/XX嵌合者5例,X0/XY嵌合者1例,X染色体部分缺失3例,假双着丝粒1例。胎儿性染色体CNVs结果除嵌合比例与染色体核型结果略有差异外基本一致,未发现新的CNV异常。详细结果见表2。
表2 除母源因素外胎儿性染色体异常的结果
数量(例)羊水FISH结果羊水培养结果CNV-seq结果5X0/XX嵌合/X0/XX嵌合1X0/XY嵌合/X0/XY嵌合4XXX/Xp22.33-q28dup155.27Mb18XXY/XXY5XYY/Yp11.32-q12dup59.37Mb3/46,X,del(X)(q25)Xq25-q28del33.52 Mb1/46,X,psu idic(X)(p11.2)Xp222.31-p111.22del50.8Mb,Xp11.22-q25嵌合性重复101.44Mb4/45,X0X0
2.NIPT提示SCAs异常的结果分析:对NIPT原始测序数据进行重分析,发现母体或胎儿性染色体存在X染色体数量及结构异常时,X染色体Z值均存在显著异常,但在假阳性病例中亦发现X染色体Z值严重异常者,且真阳性病例与假阳性之间未发现存在差异。胎儿性染色体存在Y染色体异常的病例,其NIPT检测Y染色体Z值显著增高,且PPV亦高(38.98%,23/59)。将孕妇按年龄分组结果如下,孕妇年龄<30岁组SCAs 的PPV为17.39%(8/46),30≤～≤34岁组PPV最高为30.49%(25/82),35≤～≤40岁组PPV为25%(8/32),>40岁组最低(6.67%,1/15),但未见统计学差异。
讨论
常见的性染色体异常主要有45,X0(Turner综合征)、47,XXY(克氏综合征) 、47,XXX(超雌综合征)和47,XYY(超雄综合征)等,这些患者的临床症状在胎儿及婴幼儿期不明显,随着年龄的增长才逐渐显现出来[4],而血清学筛查和超声检查很容易使SCAs的胎儿漏诊。羊膜腔穿刺染色体核型分析是诊断性染色体异常的有效手段,但孕妇及家属较难接受羊膜腔穿刺引起的并发症,如流产等,另外细胞培养所需时间较长,所以快速、准确、无创的产前筛查方法显得尤为重要。
Margiotti等[5]分析了9 985例行NIPT的孕妇,发现SCAs检出率为0.31%(31/9 985),总体PPV为77.3%(17/22)。Lu等[6]回顾性分析江西省36 913名单胎孕妇NIPT结果,SCAs的检出率为0.43%(157/36 913),其中153例经产前诊断证实阳性51例,阳性预测值33.33%(51/153)。袁珮等[7]对35 827例样本进行研究,发现SCAs检出率为0.24%(86/35 827),总体PPV为48.5%(32/66)。在本研究中,73 683例单胎孕妇行NIPT检测,SCAs检出率为0.24%(175/73 683),总体PPV为24%(42/175),SCAs检出率与袁珮等一致,总体PPV较低,分析其原因可能是母体性染色体异常及年龄等因素影响的结果。
袁珮等[7]在36例NIPT提示为SCAs异常病例中发现8例母源异常,比例达22.22%,推测母源因素是导致NIPT中SCAs假阳性的一个主要原因,并且发现NIPT结果中X染色体Z值与母体SCAs异常无相关性。本研究中SCAs高风险的175例孕妇共发现14例孕妇本人性染色体异常但所孕育的胎儿性染色体正常的病例,占比较低(8%)的原因可能是由于FISH技术的局限性,探针只是设计在着丝粒附近,并非整条染色体,所以FISH的结果未见异常并不能完全排除孕妇性染色体异常的可能。Liu等[8]发现其阳性预测值随年龄升高的变化趋势为先升高再降低,以30≤～≤34岁年龄组的阳性预测值最高。本研究与之基本一致,PPV较高的亦是该年龄组的孕妇。另外本研究发现真阳性42例,假阳性133例,真阳性与假阳性患者的性染色体相应的Z值并未发现存在差异。胎儿性染色体正常者119例,其中XX 83例,XY 36例,Y染色体异常的胎儿23例,相对来说NIPT对性染色体为XX的胎儿假阳性率更高一些。齐政等[9]也认为可能是孕妇无Y染色体,其血浆中获得的胎儿Y染色体更容易与母体染色体区分,所以NIPT对包含Y染色体的SCAs的检出更准确。黄婷婷等[10]认为NIPT筛查性染色体数目减少的阳性预测值较低,可能是来源于父亲的 X 染色体在胎盘组织中更易发生随机失活,而这些有待进一步的研究。
综上所述,NIPT用于产前筛查SCAs具有较高的临床应用价值和发展前景,但其准确性还有待提高。检测前需要全面的进行遗传咨询,尤其对于NIPT结果提示高风险的孕妇,要充分告知NIPT的优缺点和局限性,为明确诊断,建议其进一步行侵入性的产前诊断。
1 Lo YM,Corbetta N,Chamberlain PF,et al.Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum.Lancet,1997,350:485-487.
2 王燕,陈雪美,林敏,等.无创产前筛查技术筛查胎儿性染色体变异的效能评价.中华医学遗传学杂志,2021,38:325-328.
3 沈福民.流行病学原理与方法.上海:复旦大学出版社/上海医科大学出版社,2001:98-107.
4 Xie X,Wang M,Goh ES,et al.Noninvasive Prenatal Testing for Trisomies 21,18,and 13,Sex Chromosome Aneuploidies,and Microdeletions in Average-Risk Pregnancies:A Cost-Effectiveness Analysis.J Obstet Gynaecol Can,2020,42:740-749.
5 Margiotti K,Cesta A,Dello Russo C,et al.Cell-free DNA screening for sex chromosomal aneuploidies in 9985 pregnancies:Italian single experience.BMC Res Notes,2020,13:167.
6 Lu W,Huang T,Wang XR,et al.Next-generation sequencing:a follow-up of 36,913 singleton pregnancies with noninvasive prenatal testing in central China.J Assist Reprod Genet,2020,37:3143-3150.
7 袁珮,张玢,刘建兵,等.母体性染色体异常对无创产前检测胎儿性染色体非整倍性的影响.中华医学遗传学杂志,2020,37:617-620.
8 Liu Y,Liu H,He Y,et al.Clinical performance of non-invasive prenatal served as a first-tier screening test for trisomy 21,18,13 and sex chromosome aneuploidy in a pilot city in China.Hum Genomics,2020,14:21.
9 齐政,翟春雅,袁碧波.无创产前检测在性染色体疾病筛查中的研究进展.中国计划生育学杂志,2021,29:1072-1076.
10 黄婷婷,卢婉,刘艳秋.无创产前基因检测在性染色体非整倍体产前筛查中的应用.实验与检验医学,2020,38:209-211,224.