孕妇肥胖(包括孕前肥胖和孕期过度增重)问题日益突出。一项meta分析发现,美国、欧洲和亚洲的孕前超重/肥胖率分别为42%、30%和10%,孕期过度增重率分别为51%、51%和37%[1]。中国孕妇基数大、孕妇肥胖人数增速快。2014年全球肥胖孕妇人数为1 460 万,其中近30%来自中国[2]。
“胎源”假说认为,许多成人期疾病与生命早期的不良暴露有关[3]。孕妇肥胖可刺激巨噬细胞积累,加剧妊娠的基础炎症状态,造成子代生命早期的炎症环境,进而可能影响较长期的铁稳态异常[4-5]。有研究发现,孕妇孕前肥胖和体重增重过度会影响母体和新生儿的铁状态,如降低母体转铁蛋白载体、降低脐带血中血清铁和铁蛋白的水平[6-7]。本课题组前期开展的动物实验研究也发现,母鼠孕前肥胖和孕期过度增重可对子鼠离乳后铁相关指标产生不利影响[8]。
哺乳期合理膳食对子代生长发育及长远期健康有显著影响,而肥胖母亲分娩后调整哺乳期饮食是否对子代健康产生影响尚缺乏研究证据。动物研究提示,孕期饲喂高脂饮食母鼠在哺乳期调整饮食后可以改善子代体重、血糖和总胆固醇水平[9]。调整哺乳期饮食是否会缓解肥胖孕妇子代的炎症状态、改善铁相关指标,有待进一步研究。本研究采用动物实验探讨孕前肥胖和孕期过度增重母鼠哺乳期饮食类型对子鼠炎性指标和铁相关指标的影响,以及炎症反应是否在母鼠哺乳期饮食对子鼠铁相关指标影响中发挥机制作用,为改善肥胖孕妇的子代健康水平提供依据。
材料与方法
一、仪器、试剂与饲料
实验仪器主要包括电子天平(上海越平科学仪器有限公司)、高速离心机(Eppendorf Centrifuge 5424R)、酶标仪(Rayto RT-6100,450nm)和全自动血细胞分析仪(Nihon MEK-6400)。全自动血细胞分析仪配套试剂主要包括稀释液MEK-640、溶血剂MEK-680、清洗液MEK-520和强力清洗液MEK-620,酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒包括大鼠白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、铁调素(hepcidin)和铁蛋白(ferritin)试剂盒,购自北京冬歌博业有限公司。
实验饲料包括标准饲料和高脂饲料。标准饲料为大鼠生长繁殖饲料(北京科澳协力饲料有限公司),原料成分包括玉米、豆粕、鱼粉、面粉、酵母粉、植物油、食盐、磷酸氨钙、多种维生素和矿物元素等。高脂饲料为Research Diets D12492(北京凯国科技有限公司),常用于脂肪肝、炎症、肥胖和糖尿病等动物实验研究。标准饲料和高脂饲料三大营养素的供能比如表1所示。
表1 标准饲料与高脂饲料三大营养素的供能比
Table 1 Energy supply ratios of the three major nutrients of standard and high-fat diets
DietsCarbohydrates(%)gkcalProteins(%)gkcalFat(%)gkcalTotalEnergykcal/gStandard chow—63.03—24.02—12.953.44High-fat diet26.320.0026.320.0034.960.005.24
二、动物饲养及分组
本实验动物为6周龄SPF级Wistar健康雌性大鼠24只[体重(178±7)g]和配种用13周龄SPF级Wistar健康雄性大鼠24只[体重(380±20)g],均购自北京维通利华实验动物技术有限公司[实验动物生产许可证:SCXK(京)2016-0006],饲养于北京大学医学部实验动物科学部[实验动物使用许可证号:SYXK(京)2016-0041]。饲养室温(22±2)℃,相对湿度50%～60%,所有实验动物自由饮水和采食饲料。
本实验首先构建孕前肥胖和孕期过度增重母鼠模型(建模细节已在前期研究中详述[8]),然后探讨母鼠哺乳期饮食调整对子鼠炎性和铁相关指标的影响,具体如下(图1):24只SPF级Wistar雌性大鼠适应性饲喂1周后,采用随机数字表法以1∶1的比例随机分至孕前肥胖组(Pre-obese,n=12)和孕期过度增重组(GWG,n=12),Pre-obese组和GWG组分别于孕前6周和孕前10 d转为高脂饲料,其余时间饲喂标准饲料。进入哺乳期后,将每窝别子鼠数量调整为6只,并调整孕前肥胖与孕后肥胖组母鼠饮食:两组各随机选择6只母鼠将其哺乳期饮食由高脂饲料调整为标准饲料,其余母鼠饮食保持不变。即结合哺乳期饮食情况,可将动物分为4组:孕前肥胖-哺乳期高脂饮食组(Pre-HF)、孕前肥胖-哺乳期标准饮食组(Pre-SC)、孕期过度增重-哺乳期高脂饮食组(Post-HF)和孕期过度增重-哺乳期标准饮食组(Post-SC)。哺乳3周后母鼠乙醚麻醉处死,在4组中从每窝分别随机抽取2～3只子鼠纳入离乳后研究,每组12只(雌雄各半),共计48只。离乳后,所有子鼠均自由饮水和采食标准饲料,离乳21 d后子鼠乙醚麻醉处死。
图1 实验设计
Figure 1 Experiment design
本实验已通过北京大学生物医学伦理委员会实验动物福利伦理分委会批准(批准号:LA2017273)。
三、体重测量、血液采集和指标检测
实验期间记录母鼠和子鼠体重。母鼠孕前体重定义为与雄鼠第一次交配前的体重,孕期增重定义为孕期第19天与孕期第1天体重之差。于出生后第0(出生体重)、7、14、21、28、35和42天测量子鼠体重,于出生后第28、35和42天(即离乳后第7、14和21天)采集子鼠眼眶内眦静脉血1.0～1.2 mL。部分全血标本经1 500 g离心20min,取上层血清,血标本均置于-80℃保存。采用全自动血细胞分析仪检测全血标本中血红蛋白(hemoglobin,Hgb)、平均血红蛋白量(mean corpuscular hemoglobin,Mch)和平均红细胞体积(mean corpuscular volume,Mcv);采用ELISA试剂盒检测血清标本中IL-6、Hepcidin和Ferritin的水平;所有标本均重复测量,均值纳入最终分析。
四、统计学处理
连续性变量包括体重、炎性和铁相关指标采用均数±标准差表示。采用重复测量资料的方差分析开展不同哺乳期饮食组间比较,若数据不满足球形检验,则采用Greenhouse-Geisser法进行校正。若分组和时间交互项存在统计学意义,则采用Bonferroni法分时点比较指标水平的组间差异;若分组和时间交互项无统计学意义,则比较指标平均水平的组间差异。数据分析采用SPSS 26.0统计分析软件完成,检验水平为双侧α=0.05。
结 果
一、母鼠哺乳期饮食对子鼠出生后体重的影响
Pre-HF、Pre-SC、Post-HF和Post-SC组母鼠子代体重随时间均呈上升趋势,但上升趋势存在组间差异(饮食×时间,F=3.214,P=0.021;时间,F=2138.732,P<0.001;饮食,F=8.774,P<0.001)(图2和表2)。Pre-SC组子代在出生后第7天至第42天体重显著低于Pre-HF组,Post-SC组子代在出生后第21天体重显著低于Post-HF组。
图2 子鼠出生后42 d内体重变化
Figure 2 Body weight within 42 days after birth in offspring
表2 子鼠出生后42 d内体重(Mean±SD,g)
Table 2 Body weight within 42 days after birth in offspring (Mean±SD, g)
TimeafterbirthPre-obesePre-HF(n=12)Pre-SC(n=12)Excessive GWGPost-HF(n=12)Post-SC(n=12)Day 0 6.38±0.66 6.57±0.66 6.43±1.08 6.43±0.35Day 716.18±2.2013.41±1.77∗16.37±2.4615.18±1.17Day 1442.01±5.3129.92±2.44∗39.72±5.3235.86±4.36Day 2178.49±9.0155.13±4.51∗80.83±7.2963.26±5.44#Day 28109.67±8.1889.64±8.64∗108.40±13.3698.68±7.67Day 35161.17±15.24137.83±12.79∗155.11±19.48147.38±14.92Day 42215.28±31.82183.85±26.61∗199.37±26.35193.64±25.63
Compared with Pre-HF, *P<0.05. Compared with Post-HF, #P<0.05.
二、母鼠哺乳期饮食类型对子鼠炎性指标和铁相关指标的影响
1.孕前肥胖:哺乳期饮食对孕前肥胖母鼠子代IL-6和Hepcidin水平均有显著影响(图3)。Pre-SC组子代IL-6水平在出生后第28天(105.24 pg/mL vs. 152.97 pg/mL,P<0.017)、 第35天(110.53 pg/mL vs. 155.15 pg/mL,P<0.017)、第42天(139.02 pg/mL vs. 155.4 pg/mL,P<0.017)均显著低于Pre-HF 组(饮食×时间,F=10.26,P<0.001)。Pre-SC组子代三次Hepcidin的平均水平也显著低于Pre-HF组(99.67ng/mL vs. 119.99ng/mL,P<0.001;饮食×时间,F=2.17,P=0.126)。哺乳期饮食对孕前肥胖母鼠子代Ferritin、Hgb、Mch和Mcv水平均有显著影响(图3)。Pre-SC组子代Mch(23.32 pg vs. 22.43 pg,P=0.005;饮食×时间,F=0.41,P=0.604)和Mcv的平均水平(75.71 fL vs. 72.71 fL,P=0.004;饮食×时间,F=1.964,P=0.171)较Pre-HF组子代显著升高,而Ferritin(42.06 ng/mL vs. 50.60 ng/mL,P<0.001;饮食×时间,F=1.932,P=0.157)和Hgb的平均水平(106.28 g/L vs. 110.53 g/L,P=0.034;饮食×时间,F=2.816,P=0.071)较Pre-HF组子代显著降低。
Compared withPre-HF, *P<0.05. Compared with Post-HF, #P<0.05.
图3 哺乳期饮食对孕期肥胖和孕期过度增重母鼠子代炎性指标和铁相关指标的影响
Figure 3 Effect of lactation diet in rats with pre-pregnancy obesity and excessive gestational weight gain on inflammatory and iron-related indicators in the offspring
2.孕期过度增重:哺乳期饮食对孕期增重过度母鼠子代IL-6和Hepcidin水平均有显著影响(图3)。Post-SC组子代IL-6水平在出生后第35天(127.57 pg/mL vs. 140.21 pg/mL,P<0.017)显著低于Post-HF组(饮食×时间,F=4.843,P=0.013)。Post-SC组子代Hepcidin水平在出生后第28天(97.34 ng/mL vs. 131.2 ng/mL,P<0.017)和第35天(89.02 pg/mL vs. 128.09 pg/mL,P<0.017)显著低于Post-HF组,但在第42天(109.98 ng/mL vs. 91.93 ng/mL,P<0.017)显著高于Post-HF组(饮食×时间,F=36.198,P<0.001)。哺乳期饮食对孕期增重过度子代Ferritin、Hgb和Mcv水平均有显著影响,对Mch影响不显著(图4)。Post-SC组子代Ferritin水平在出生后第28天(41.1 ng/mL vs. 52.28 ng/mL,P<0.017)和第35天(37.61 ng/mL vs. 57.86 ng/mL,P<0.017)显著低于Post-HF组,在第42天(46.57 ng/mL vs. 39.54 ng/mL,P<0.017)显著高于Post-HF组(饮食×时间,F=44.746,P<0.001)。Post-SC组子代Hgb水平在出生后第35天显著高于Post-HF组(112.92 ng/mL vs. 107.25 ng/mL,P<0.017;饮食×时间,F=6.988,P=0.002)。Post-SC组子代Mcv的平均水平显著低于Post-HF组子代(74.34 fL vs. 72.90 fL,P=0.025;饮食×时间,F=0.308,P=0.64)。
3.炎性指标的中介效应分析:调整炎性指标IL-6和Hepcidin后,哺乳期饮食对孕前肥胖母鼠子代离乳后的Ferritin(饮食×时间,P=0.505;饮食,P=0.657)、Hgb(饮食×时间,P=0.705;饮食,P=0.999)、Mch(饮食×时间,P=0.651;饮食,P=0.742)和Mcv(饮食×时间,P=0.268;饮食,P=0.687)水平的影响不再显著。调整炎性指标IL-6和Hepcidin后,哺乳期饮食对孕期过度增重母鼠子代离乳后的Ferritin(饮食×时间,P=0.134;饮食,P=0.110)、Hgb(饮食×时间,P=0.039;饮食,P=0.285)和Mcv(饮食×时间,P=0.490;饮食,P=0.111)水平的影响不再显著。详见表3。
表3 炎性指标在哺乳期饮食与孕前肥胖和孕期过度增重母鼠子代铁相关指标关联的中介效应分析
Figure 3 Mediation effect analysis of inflammatory indicators in the association of lactation diet in rats with pre-pregnancy obesity and excessive gestational weight gain on inflammatory and iron-related indicators in the offspring
Iron-related indicatorsTime after birthFPTime after birth×Maternaldiet during lactationFPMaternal diet during lactationFPTime after birth∗FPTime after birth×Maternal diet during lactation∗FPMaternal diet duringlactation∗FPOffspring rats of Pre-obesegroup Ferritin(ng/mL)28.861<0.0011.9320.15717.904<0.0016.6290.0030.6940.5050.2020.657 Hgb(g/L)76.872<0.0012.8160.0715.0910.03435.583<0.0010.3520.705<0.0010.999 Mch(pg) 42.659<0.0010.4140.6039.6450.00531.969<0.0010.3390.6510.1110.742 Mcv(fL) 32.079<0.0011.9640.17110.473<0.00124.287<0.0011.3370.2680.1660.687Offspring rats of excessive GWG group Ferritin(ng/mL) 5.5960.00744.746<0.00157.883<0.0011.6580.2022.1040.1342.7790.110 Hgb(g/L)240.933<0.0016.9880.0021.050 0.317140.892<0.0013.5060.0391.1980.285 Mch(pg) 100.190 <0.001 0.624 0.540 2.722 0.132 70.320<0.0010.1300.8780.7070.409 Mcv(fL)68.097<0.0010.3080.640 5.804<0.00146.691<0.0010.5880.4902.7590.111
*Adjusted for IL-6 and hepcidin
讨 论
本研究发现,哺乳期标准饮食可以显著降低孕前肥胖和孕期过度增重母鼠子代出生后体重。魏铭等[10]的研究发现母鼠孕期和哺乳期高脂饮食子代在出生后3周时的体重显著高于标准饮食组。母鼠高脂饮食可以影响子代下丘脑的摄食通路,上调促进食欲的神经肽NPY/AGRP的表达,下调降低食欲的神经肽POMC的表达,从而导致子代持续食欲过盛[11]、过度进食、体重显著增加。另有研究发现,哺乳期高脂饮食可能通过增加母鼠的泌乳量导致子鼠的摄食量增加,引起子鼠生长和代谢的改变[12]。基于上述研究结果,本研究推测本研究哺乳期标准饮食组子鼠体重降低可能与母鼠泌乳量和子代食欲均降低有关。
本研究发现,哺乳期标准饮食可以显著降低孕前肥胖和孕期过度增重母鼠子代的IL-6和Hepcidin水平,提示哺乳期标准饮食可降低孕期肥胖母鼠子代的炎症水平。与陈雪等[9]的研究结果一致,该研究采用子鼠交叉喂养方式,发现孕期和(或)哺乳期高脂饮食使子鼠体重、血糖、脂肪含量升高,血清炎症因子(IL-6、TNF-α和IL-12)表达增加;若孕期高脂饮食母鼠在哺乳期恢复正常饮食后,其子代血清TNF-α浓度表现出下调趋势,炎症水平改善,且子代体重、血糖和总胆固醇水平降低。啮齿动物研究[13]表明,孕期高脂饮食母鼠乳汁中表现出较高的miR-26a、miR-222和miR-484表达水平,进而激化促炎趋化因子,增加促炎因子的表达水平;母鼠哺乳期恢复正常饮食后,上述标志物表达水平恢复正常。因此,哺乳期标准饮食组子鼠炎症水平的改善可能与母鼠乳汁中炎症因子水平的降低有关。此外,在肥胖状态下,巨噬细胞会释放炎症因子,造成慢性低度炎症环境[14],而母鼠哺乳期高脂饮食会增加子代出生后体重,后代更容易诱发肥胖[15],故哺乳期饮食调整也可能通过降低子代体重而降低炎症水平。
本研究发现,哺乳期标准饮食可以显著升高孕前肥胖母鼠子代的Mch和Mcv水平和孕期过度增重母鼠子代的Hgb和Mcv水平,提示哺乳期标准饮食可以改善孕期肥胖母鼠子代的铁相关指标水平。本研究还发现,调整炎性指标IL-6和Hepcidin后,母鼠哺乳期饮食对子代多个铁相关指标的影响不再显著,提示炎症反应可能在母鼠哺乳期饮食与子鼠铁相关指标关联中发挥机制作用。Hepcidin是铁平衡的重要调节因子之一,哺乳期标准饮食母鼠子代炎症反应改善、Hepcidin水平降低[16]可促进巨噬细胞铁释放和十二指肠铁吸收从而升高血液循环铁水平[17]。此外,既往研究还发现高脂饮食相关的代谢物可通过母鼠乳汁传递至子代[18-19],故哺乳期饮食调整也可能通过改变乳汁代谢物成分和水平而影响子鼠的炎症和铁相关指标。
此外,本研究部分发现与预期不完全符合,比如哺乳期标准饮食较高脂饮食可显著降低孕前肥胖和孕期过度增重母鼠子代的Ferritin水平。Ferritin是用于评估人体铁储存的指标[20],同时也是一种急性期反应物,受炎症水平的影响,随炎症水平升高而升高[21]。故本研究中,哺乳期标准饮食组子代Ferritin水平偏低可能与其炎症水平偏低有关。本研究还发现哺乳期标准饮食可显著降低孕前肥胖母鼠子代Hgb水平,这可能与测量误差有关,有待进一步研究。
综上所述,孕期肥胖母鼠的哺乳期饮食可影响子代铁相关指标的水平,炎症反应是可能机制之一。本动物实验存在一定局限性:(1)本研究未能评估饲料中铁元素摄入量对研究结果的影响;(2)本研究仅分析了子代出生后42 d内铁相关指标的变化,不能完全评估哺乳期饮食对子代较长期铁相关指标的影响。在孕期肥胖率较高的背景下,将来有待开展人群研究以明确孕期肥胖对子代铁相关指标的长期影响,为临床控制孕期肥胖提供新证据。
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