复发性流产(recurrent pregnancy loss,RPL)是2次及以上失败的临床妊娠[1],发生率约5%[2],其中约50%病因不清楚,称为不明原因复发性流产。随着免疫学的进展,发现不明原因RPL与免疫失衡关系密切。2016年国内发布的《复发性流产诊治的专家共识》中将不明原因RPL称为同种免疫型复发性流产[3]。胚胎携带一半父系来源的抗原,进入母体后,母体为保护胚胎免受免疫系统的攻击,通过免疫调节产生封闭抗体,与滋养叶抗原或母体淋巴细胞结合,避免胚胎遭受母体的免疫攻击[4]。封闭抗体(blocking antibody,BA)是人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)、滋养层及淋巴细胞交叉反应抗原等刺激母体免疫系统,所产生的一类IgG型抗体。正常的妊娠中,通过激活精子中的滋养层-淋巴细胞交叉免疫抗原,产生IgG封闭抗体,该抗体结合在滋养细胞表面Fc受体,避免胚胎遭受母体的免疫攻击。有研究提出,母胎HLA相容性的增加和母亲对抑制性免疫反应敏感性的增加,夫妇HLA相容性的增加,母体HLA易感基因的存在导致母体免疫系统对胚胎抗原无法识别,导致母体封闭抗体的减少,从而导致流产[5-6]。HLA特异性IgG抗体是HLA分子刺激母体免疫系统产生的IgG型抗体,包括HLA-Ⅰ类抗体和HLA-Ⅱ类抗体。
淋巴细胞免疫治疗(lymphocyte immunotherapy,LIT)是不明原因RPL免疫治疗方法中的一种,自1981年Taylor和Faulk基于母体胚胎排斥理论,首次应用LIT治疗不明原因RPL患者并取得成功[7],LIT得以在临床上推广。多项研究表明,LIT降低不明原因RPL患者的流产率[8-11]。LIT的机制尚不清楚,基于免疫学原理,HLA抗原主要是在淋巴细胞表面表达,当注射作为抗原的淋巴细胞后,体内会产生相应的HLA抗体。因此,理论上在治疗前后对HLA抗体进行检测,一方面可以筛选适合做LIT的患者,另一方面通过前后对比,可有效监控LIT是否已经达到相应的效果。
应用2种方法检测HLA特异性IgG抗体[12],一种是常规的酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),将HLA抗原包被在ELISA板的不同孔中,利用抗原抗体结合专一性进行检测;另一种方法是近年来开展的流式细胞仪—微珠法,检测血清首先和磁珠进行孵育,HLA抗原与被测抗体结合,应用流式细胞仪检测磁珠的荧光强度,理论上灵敏度较ELISA方法提高。
本研究使用纯化的HLA抗原作为不明原因RPL患者血清中HLA抗体的靶抗原,排除了由患者血清中非抗HLA抗体所导致的假阳性反应,改善检测的特异性,并可以区分HLA-Ⅰ类和Ⅱ类抗原抗体反应。应用ELISA法和流式细胞仪—微珠法分别检测不明原因RPL患者免疫治疗前后及正常生育人群的的HLA抗体,研究目的:(1)研究不明原因RPL患者和正常生育人群HLA抗体的状态;(2)LIT能否促进HLA抗体转阳;(3)对比不明原因RPL患者LIT后HLA抗体与妊娠结局,评估HLA抗体是否可作为LIT预测妊娠结局的有效指标。
对象和方法
1.研究对象:(1)RPL组。选取2014年12月3日至2015年6月10日在北京大学第三医院生殖中心门诊就诊的不明原因复发性流产患者24例作为RPL组,纳入标准:①年龄20～40岁;②与同一性伴侣连续遭受2次及以上妊娠20周前的自然流产,生化妊娠除外;③夫妻染色体G带染色核型分析正常;④常规妇科盆腔检查、经阴道超声检查和宫腔镜检查均排除生殖系统解剖异常;⑤生殖内分泌激素正常,包括性激素六项(卵泡刺激素、黄体生成素、雌激素、孕酮、睾酮、雄烯二酮)、甲状腺功能(血清总三碘甲状腺原氨酸、血清总四碘甲状腺原氨酸、血清游离三碘甲状腺原氨酸、血清游离四碘甲状腺原氨酸、血清促甲状腺激素)、血糖和胰岛素;⑥TORCH-IgM(弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒)阴性;⑦阴道分泌物常规检查正常,无支原体、衣原体等生殖道感染;⑧自身抗体阴性,包括抗核抗体、抗双链DNA抗体、抗心磷脂抗体(IgM、IgG)、抗β2糖蛋白抗体(IgM、IgG);⑨同型半胱氨酸正常;⑩既往流产胚胎染色体未见异常。本研究通过北京大学第三医院生殖医学伦理委员会伦理审查(项目编号2011S2017)。
根据HLA的状态分为四类,分别为仅有HLA-Ⅰ类抗体阳性(简称Ⅰ类阳性);仅有HLA-Ⅱ类抗体阳性(简称Ⅱ类阳性);HLA-Ⅰ类与Ⅱ类抗体均阳性(简称双阳性);HLA-Ⅰ类与Ⅱ类抗体均阴性(简称双阴性)。根据妊娠结局分组,分为妊娠成功组和妊娠失败组。
(2)对照组。选取于北京大学第三医院体检中心体检的健康未孕女性30例作为对照组,纳入标准:①年龄20～40岁;②至少1次足月分娩;③无死胎、死产、自然流产、早产等不良孕产史;④无内分泌、感染、自身免疫性疾病史;⑤距离末次分娩1年以上。
2.LIT:治疗前对患者及配偶的传染病相关指标进行检查,主要包括乙肝五项、丙肝抗体、梅毒螺旋体、艾滋病病毒,均正常后方可进行淋巴细胞免疫治疗,若丈夫因为血液传播性疾病或其他原因不宜作为免疫原,选用第三方健康个体(男性或女性均可,与女方无血缘关系)。空腹采配偶(或第三方)静脉血15 毫升/次肝素抗凝,在无菌条件下用淋巴细胞专用分离液分离淋巴细胞,生理盐水洗涤2次,弃上清液,再用生理盐水0.8～1.0 mL稀释淋巴细胞,每次可获得淋巴细胞数约1×107～3×107,于患者前臂皮内注射4～6个点,每点约0.2 mL注射。妊娠前每2周注射1次,共4次,治疗过程中严格避孕,治疗后解除避孕,妊娠后再治疗2次,间隔2周。
3.外周血标本采集和血清制备:知情告知后,RPL组患者第一次LIT前和第四次LIT结束后1月、健康生育组体检当日,分别于早晨空腹用促凝剂+分离胶真空采血管抽取静脉血4 mL,采血后立即颠倒混匀5～6次。应用低速离心机3 000 rpm离心10 min,分离上层血清至EP管内,详细标注样本信息后置于-80℃低温冰箱中冻存备用。
4.HLA特异性IgG抗体检测(ELISA法):莱姆德抗原混合板(LATM,One Lambda公司,美国),采用ELISA法,在BIOTEK酶标仪(ELX800 NB,美国Biotek)波长630 nm下读取结果,并使用HLA Fusion 3.1(美国One Lambda)专用分析软件分析结果。
5.HLA特异性IgG抗体检测(LABScreen法):包被HLA抗原的免疫微珠购自美国One Lambda公司。患者血清用混合微珠检测(LABScreenTM Mixed,美国One Lambda),具体操作方法如下:20 uL血清高速离心后与5 uL免疫微珠在室温下避光孵育30 min,洗板3次后,加入100 uL的1:100 PE-羊抗人IgG 结合物(LS-AB2,美国One Lambda),避光孵育30 min,洗板2次后,在Luminex仪器(LABScanTM 100,美国Luminex)上读取结果,并用美国One Lambda公司专用分析软件(HLA Fusion 3.1)进行分析。对于LABScreen MIX来说,NBG比值大于3或Baseline值第一高于500或Baseline值第三高于300作为阳性界定的阈值。
6.统计学处理:应用SPSS 23.0软件进行统计学分析。应用Kolmogorov-Smirnov方法行正态性检验,正态分布计量资料用均数±标准差表示,两组间比较用独立样本t检验,多组间比较用方差分析。非正态分布资料用均数(最小值,最大值)表示,组间比较用非参数检验。计数资料用例数(百分比)表示,组间比较用χ2检验,若最小期望值>5,用Pearson卡方;若1<最小期望值<5,用连续校正;若最小期望值<1,用Fisher精确检验。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1.一般资料:24例RPL组患者均于免疫治疗结束后1年内妊娠,其中15例(62.5%,15/24)已足月分娩,新生儿随访中1例男婴尿道下裂;9例(37.5%,9/24)再次发生早孕期自然流产。根据妊娠结局不同将RPL组分为妊娠成功组和失败组。三组男女年龄、自然流产次数比较,差异均无统计学意义。见表1。
表1 三组的一般资料
组别例数女方年龄(岁)男方年龄(岁)自然流产次数(次)RPL组 妊娠成功组1531.7±3.432.8±3.82(2,4) 妊娠失败组931.0±3.631.3±3.63(2,4)对照组3031.9±3.532.5±2.5—
2.HLA特异性IgG抗体检测结果(ELISA法):
(1)RPL组LIT前和对照组HLA抗体阳性率的比较。
RPL组LIT前和对照组HLA抗体的阳性率比较,差异无统计学意义,见表2。
表2 RPL组LIT前和对照组HLA抗体阳性率的比较(ELISA法)[例(%]
组别例数Ⅰ类阳性Ⅱ类阳性双阳性双阴性RPL组LIT前241(4.2)0(0.0)1(4.2)22(91.7)对照组301(3.3)2(6.7)0(0.0)27(90.0)
(2)RPL组LIT后HLA抗体转阳情况。
如表2所示,LIT前HLA-Ⅰ类抗体阳性(包括双阳性)2例、HLA-Ⅱ类抗体阳性(包括双阳性)1例,抗体双阳性1例,抗体双阴性22例。去除LIT前HLA抗体阳性者,LIT后HLA-Ⅰ类抗体4例转阳,转阳率18.1%(4/22);HLA-Ⅱ类抗体5例转阳,转阳率21.7%(5/23);HLA-Ⅰ类和Ⅱ类抗体均转阳共有6例,转阳率27.3%(6/22)。
(3)RPL组LIT后HLA抗体与妊娠结局关系。
LIT后HLA-Ⅰ类抗体阳性活产率为40%(2/5),HLA-Ⅱ类抗体阳性率为80%(4/5),双抗体阳性活产率为3/7(42.9%),双抗体阴性活产率为6/7(85.7%),不同HLA状态的活产率差异无统计学意义(P=0.320)。LIT前HLA抗体阳性患者(1例仅Ⅰ类阳性、1例双阳性),LIT后抗体仍为阳性,且均足月分娩。
3.HLA特异性IgG抗体检测结果(流式细胞仪-微珠法):
(1)RPL组LIT前和对照组HLA抗体阳性率的比较。RPL组LIT前和对照组HLA抗体的阳性率比较,差异无统计学意义,见表3。
表3 RPL组LIT前和对照组HLA抗体阳性率的比较(流式细胞仪-微珠法)[例(%]
组别例数Ⅰ类阳性Ⅱ类阳性双阳性双阴性RPL组LIT前247(2.9)1(4.2)1(4.2)15(62.5)对照组3012(40.0)2(6.7)3(10.0)13(43.3)
(2)RPL组LIT后HLA抗体转阳情况。
如表3所示,LIT前HLA-Ⅰ类抗体阳性(包括双阳性)8例、HLA-Ⅱ类抗体阳性(包括双阳性)2例,抗体双阳性1例,抗体双阴性15例。去除LIT前HLA抗体阳性者,LIT后HLA-Ⅰ类抗体2例转阳,转阳率12.5%(2/16);HLA-Ⅱ类抗体1例转阳,转阳率4.5%(1/22);HLA-Ⅰ类和Ⅱ类抗体均转阳共有12例,转阳率80%(12/15)。
(3)RPL组LIT后HLA抗体与妊娠结局关系。
LIT后HLA-Ⅰ类抗体阳性活产率为50%(2/4),HLA-Ⅱ类抗体阳性率为100%(1/1),双抗体阳性活产率为11/18(61.1%),双抗体阴性活产率为1/1(100%),以上4组活产率差异无统计学意义(P=1.000)。LIT前HLA抗体阳性者LIT后仍为阳性,LIT前Ⅰ类抗体阳性者7例,其中5例妊娠成功,妊娠成功率71.4%;Ⅱ类抗体阳性者1例,妊娠成功;双阳性者1例,妊娠成功。
4.ELISA法和流式细胞仪-微珠法检测结果比较:ELISA法HLA抗体阳性在流式细胞仪-微珠法中亦均为阳性,ELISA法中未发现的HLA抗体阳性亦可以通过流式细胞仪-微珠法检测,推测流式细胞仪-微珠法的灵敏度较ELISA法高。
讨论
不明原因RPL进行LIT的指征存在争议,多项研究表明HLA抗体与LIT相关,临床上甚至将HLA阴性作为URPL患者LIT治疗的指征,将HLA转阳视为LIT治疗有效的指标,但存在诸多争议,亟需不明原因RPL患者HLA抗体与LIT相关性的研究。本研究采用ELISA法和流式细胞仪—微珠法两种方法均发现,RPL患者LIT前的HLA抗体的阳性率与对照组差异无统计学意义,LIT后转阳性组和未转阳性组的妊娠结局无差异,提示不能通过非孕期HLA抗体预测不良的妊娠结局,也不能通过LIT后是否转阳预测妊娠结局。
不明原因RPL患者的HLA抗体状态存在争议。部分研究提示,RPL患者HLA抗体阳性率低。Bartel等[13]应用流式细胞仪—微珠法测定HLA抗体,发现RPL患者HLA抗体的阳性率(19%)明显低于正常生育产后妇女(49%)。亦有结果相反,Meuleman等[14]研究发现复发性流产患者早孕期的HLA-C抗体阳性率明显高于无不良孕产史的早孕期妇女。本研究未发现RPL患者与对照组HLA抗体的差异。Meuleman等[14]研究中检测的HLA-C抗体是HLA-Ⅰ类抗体的一种,HLA-Ⅰ类抗体包括HLA-A、B、C抗体,HLA-Ⅱ类抗体包括HLA-DR、DQ、DP抗体,提示可能HLA的某一种抗体与RPL更密切,需要进一步的研究。
本研究发现RPL患者LIT后转阳性组和未转阳性组的妊娠结局无差异,并进一步分析4种HLA状态的妊娠成功率,差异也无统计学意义,HLA-Ⅰ类、HLA-Ⅱ类抗体或者两者结合均不能预测妊娠结局。2013年Lashley等[15]Meta分析亦提示HLA-Ⅰ类或HLA-Ⅱ类抗体均与妊娠结局无关,本研究结果也是如此。分析原因可能有:(1)HLA抗体是封闭抗体的一大类,不能代表全部的封闭抗体;(2)HLA抗体并非特异性针对父系HLA抗原;(3)本研究样本量小,需要进一步扩大样本量;(4)LIT治疗RPL的机制尚不明确,可能不是通过HLA抗体,而是通过体内的一些免疫细胞和细胞因子的数量和功能介导[16-17] 。
关于HLA抗体的检测方法尚无共识。本研究采用ELISA法和流式细胞仪-微珠法,分别测定RPL患者的HLA特异性IgG抗体,ELISA方法HLA抗体阳性者在流式细胞仪-微珠法中亦均为阳性,ELISA方法未发现的HLA抗体阳性可以通过流式细胞仪-微珠法检测,推测流式细胞仪-微珠法的灵敏度较ELISA法高,与吴萍萍等[18]用上述两种方法在肾移植患者中检测HLA抗体对比的结果一致。但检测方法灵敏度的比较需要完善生物学实验进一步验证。
LIT将丈夫或第三方的淋巴细胞作为免疫源输入女方体内,诱导女方产生HLA抗体,本研究提示LIT促进HLA-Ⅰ类和/或HLA-Ⅱ类抗体转阳。本研究与其他文献报道一致,赵学峰等[19]通过ELISA方法检测486例RPL患者LIT前后的封闭抗体转阳率,4次免疫治疗后封闭抗体的转阳率为77.8%。可见LIT促进HLA抗体阴性的RPL患者转阳。
结论
不明原因RPL患者LIT前HLA特异性IgG抗体与正常生育者的差异无统计学意义,LIT可以促进HLA抗体转阳,免疫治疗后不明原因RPL患者HLA特异性IgG抗体与妊娠结局无关,HLA特异性IgG抗体不能作为LIT预测妊娠结局的唯一参考指标,尚需要结合其他免疫指标综合分析。
志谢：北京大学第三医院临床流行病教研室张华老师。
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