妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP)是妊娠中晚期的一种特有疾病,由于血清总胆汁酸(total bile acid,TBA)水平升高,如不及时诊治,会导致胎儿宫内缺氧,发育迟缓,医源性早产甚至胎死宫内等不良妊娠结局的发生,严重危害母儿健康,其发病机制目前还没有完全阐明[1]。成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors,FGF )是一组对发育、器官形成和代谢具有多效性作用的蛋白质。FGF19亚家族是其中的一类生长因子,包括FGF19、FGF21和FGF23,其中FGF19和FGF21通过与其共受体β-klotho(即KLB)结合发挥作用,参与胆汁酸的肠肝循环,糖脂代谢调节,胆囊的舒缩等作用[2-6]。本研究拟通过测定FGF19、FGF21及共受体KLB在ICP患者血清中的表达水平,并通过统计学分析其与血清TBA等临床资料及实验室指标的相关性,探讨其在ICP发病过程中可能的病理机制。
对象与方法
1.研究对象:选取2020年1月—2021年12月在成都医学院第一附属医院规律产检并住院分娩的ICP 孕妇43例作为研究对象,并根据轻、重程度分为轻度22例,平均年龄(30.9±4.4)岁,重度21例,平均年龄(29.6±4.5)岁。纳入标准参照妊娠期肝内胆汁淤积症2015年诊疗指南[7],排除标准:排除妊娠合并高血压、糖尿病及恶性肿瘤等内外科疾病。选取同期无妊娠合并症以及内外科疾病的健康孕妇67例作为对照组,平均年龄(29.3±4.2)岁,三组孕妇年龄比较无统计学差异(P>0.05)。本研究获得本院医学伦理委员会的批准(批件号:2021CYFYIRB-SQ-01)以及每位孕妇的书面知情同意。
2.方法
(1)一般资料收集各组孕妇的临床数据如年龄、孕产次、孕周、分娩方式、临床生化指标、新生儿情况等一般资料。
(2)血清FGF19、FGF21、KLB检测采集各组孕妇产前空腹肘静脉血2 mL,室温静置1～2 h,3 000 r/min离心15 min分离血清,将血清样本保存在-80 ℃冰箱中待检。采用ELISA法检测血清FGF19、FGF21及共受体KLB的表达水平。抗FGF19及FGF21抗体试剂盒购自美国Abcam公司,抗KLB抗体购自北京博奥森生物技术有限公司,操作按说明书进行。
(3)统计学处理:使用 SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析处理。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差
表示。各组间比较采用t检验。采用Pearson法分析ICP孕妇血清FGF19、FGF21、KLB与临床及实验室指标的相关性。采用多因素Logistic回归模型分析相互之间的影响因素。P<0.05认为差异具有统计学意义。
结果
1.三组孕妇血清FGF19、FGF21、KLB表达水平的比较:三组孕妇中对照组、轻度ICP组、重度ICP组血清中FGF19及其共受体KLB表达水平比较无统计学差异(P>0.05),但发现血清共受体KLB在对照组、轻度ICP组、重度ICP组中的表达有升高的趋势。三组孕妇血清中FGF21蛋白水平比较有统计学差异(P<0.05),且重度ICP组与正常孕妇比较,血清FGF21显著增高(P<0.05)(表1)。
表1 三组孕妇血清FGF19、FGF21、KLB表达水平比较
组别例数FGF19(pg/mL)FGF21∗(pg/mL)KLB(ng/mL)对照组678.6±4.385.0±32.514.2±4.1轻度ICP组227.5±3.598.5±34.613.6±6.4重度ICP组2114.6±12.4119.7±46.417.9±7.6
*P<0.05
2.三组孕妇血清FGF21的表达水平与临床指标的相关性分析:以血清FGF21水平作为因变量,肝肾功能等实验室指标作为自变量,进行相关性检验发现血清FGF21水平与AST(P<0.01)、ALT(P<0.01)及TBA(P<0.01)呈正相关,其中FGF21水平与TBA水平呈显著正相关。而FGF21蛋白表达水平与GGT、DBIL差异无统计学意义(P>0.05)。血清中 FGF21 蛋白表达水平与空腹血糖、脂蛋白、低密度脂蛋白、胆固醇、高密度脂蛋白未见相关性(P>0.05)。然而,血清中 FGF21蛋白表达水平与甘油三脂(r=0.31,P<0.05)具有中等相关性(表2)。
表2 血清FGF21与临床指标的相关性分析
自变量FGF21(pg/mL)rp谷丙转氨酶(U/L) 0.270.01谷丙转氨酶(U/L) 0.280.01谷酰转肽酶(U/L) 0.120.23总胆汁酸(umol/L) 0.410.00直接胆红素(umol/L) 0.000.98空腹血糖(mmol/L) 0.000.97脂蛋白(mmol/L)-0.400.73胆固醇(mmol/L) 0.190.08甘油三酯(mmol/L)) 0.310.03低密度脂蛋白(mmol/L)) 0.180.10高密度脂蛋白(mmol/L))-0.010.43
3.三组孕妇血清FGF21与FGF19、KLB的相关性分析:血清FGF21与FGF19蛋白的表达水平无明显相关性(P>0.05),但与血清KLB的表达水平呈中等正相关(r=0.31,P<0.05)。血清FGF19与FGF21及KLB均无相关性(P>0.05)。
4.血清FGF21与新生儿情况的相关性分析:血清FGF21蛋白表达水平与分娩孕周(P<0.05)具有负相关性,而与新生儿出生体质量、出生身长、阿普加评分、羊水粪染程度不具有相关性(P>0.05)(表3)。
表3 血清 FGF21 与新生儿情况的相关性
自变量FGF21(pg/ml)rp分娩孕周(W)-0.230.02出生体质量(g) 0.090.34出生身长(cm) 0.090.34平均Apgar评分-0.110.24羊水粪染程度 0.000.97
5.三组孕妇血清FGF21与临床及生化指标的回归性分析:以血清FGF21的浓度为因变量,以TAB(mmol/L)、TG(mmol/L)、ALT(U/L)、采血孕周(w)为自变量逐步进行多元线性回归分析,回归模型具有统计学意义(P<0.00,调整R2=0.19)。总胆汁酸、甘油三脂是血清 FGF21 表达的影响因素,见表4。以血清 TAB 的浓度为因变量,以谷丙转氨酶/ALT(U/L)、谷酰转肽酶/GGT(U/L)、直接胆红素/DBIL(umol/L)、高密度脂蛋白/HDL(mmol/L)、血清FGF21(pg/ml)及既往 ICP 病史为自变量进行多元线性回归分析,回归模型具有统计学意义(P<0.00,调整R2=0.31)。血清 FGF21是血清 TAB 表达的独立影响因素(P<0.01),见表5。
表4 血清 FGF21 的多元线性回归
模型标准化系数β标准误差tP容差VIFTAB1.090.363.000.000.791.26TG5.592.262.470.020.901.11ALT0.030.070.070.670.841.19采血孕周0.701.180.590.560.841.18
表5 血清TAB的多元线性回归分析
模型标准化系数β标准误差tP容差VIFALT0.020.030.800.430.671.50GGT0.180.111.630.110.581.72DBIL1.261.650.760.450.731.37HDL-6.503.92-0.190.100.921.08FGF210.120.043.260.000.891.13ICP史4.374.740.920.360.941.07
6.FGF21预测疾病的严重程度和早产
血清FGF21预测既往ICP的ROC曲线如图1,在107.00 pg/mL的最佳截止水平下,FGF21预测既往ICP[AUC=0.72(95%CI 0.55～0.88),P<0.05]的敏感性和特异性分别为87.5%和70%。
图1 血清FGF21预测既往ICP的ROC曲线
血清TAB预测新生儿早产的ROC曲线如图2,在7.45 pg/mL的最佳截止水平下,血清TAB预测新生儿早产[AUC=0.83(95%CI 0.75～0.91),P<0.05]的敏感性和特异性分别为100%和75%。采用二元Logistics回归结合FGF21得到预测概率,新的ROC预测曲线图2,两者预测新生儿早产[AUC=0.89(95%CI 0.79～0.98),P<0.05]的敏感性和特异性分别为86%和87%。
图2 血清TAB、FGF21和TAB联合预测新生儿早产的ROC曲线
讨论
ICP易在妊娠中晚期发病,血清TBA升高是诊断ICP的主要实验室指标。随着TBA水平的升高,发生胎儿宫内窘迫、胎儿宫内发育迟缓、新生儿窒息、新生儿吸入性肺炎、病理性黄疸、缺血缺氧性脑病及颅内出血等不良妊娠结局发生率显著增加[8-9]。血清高TBA 或TBA 淤积是ICP不良妊娠结局的病理生理基础,推测由于遗传、气候、氧化应激等原因导致胆汁酸的代谢发生紊乱,从而引起胆汁酸淤积。
FGF19亚家族是一类具有内分泌特性的成纤维细胞生长因子,包括FGF19,FGF21及FGF23,它们与受体klotho结合发挥作用。Klotho有2种,即α-Klotho与FGF23结合,β-Klotho(即KLB)与FGF19和FGF21结合,致使FGF19和FGF21有竞争关系。近年研究发现FGF19,FGF21与氧化应激、糖脂代谢和胆汁酸代谢发挥重要作用[2-6,10-11]。王实[12]等通过对ICP患者血清FGF19及Klotho mRNA的研究发现,ICP孕妇血清FGF19水平高于正常妊娠孕妇,而Klotho mRNA水平低于正常妊娠孕妇,两者呈负相关,且和不良妊娠结局相关。但是本研究结果提示ICP孕妇和正常妊娠孕妇血清FGF19和KLB比较差异无统计学意义,与Tayyar[13]等学者研究结果一致,其在检测40例ICP孕妇和40例正常妊娠孕妇的血清FGF19与β-klotho的水平时发现两者在两组孕妇的水平表达未见统计学差异。本研究和上述研究结果存在差异,可能的原因是由于检测方法或样本量偏少有关,至于FGF19及其受体KLB是否在ICP患者TBA代谢调节中发挥何种作用还需要进一步研究探索。
FGF21也是参与胆汁酸代谢调节的重要细胞因子之一,其通过与FGF19竞争与受体β-klotho(即KLB)结合而发挥负反馈作用,近年研究发现FGF21在妊娠合并代谢紊乱性疾病如妊娠期高血压、子痫前期、妊娠期糖尿病等都表现为上调[14-16],有趣的是,在产后FGF21的水平会降到孕前水平,推测FGF21在这些疾病的发病机制中发挥了保护作用。
本研究首次发现了ICP孕妇血清中FGF21表达增加,且重度ICP患者增加的更明显。在相关性分析中,发现了血清中FGF21水平与AST、ALT、TBA、TG具有正相关性。另外,血清FGF21与KLB呈中等正相关,而与FGF19无明显相关性。对于新生儿情况,血清FGF21蛋白表达水平仅与分娩孕周具有轻度相关性。
Klotho是一种于1997年发现的具有抗衰老作用的基因[17],其人类编码的基因产物包括α-Klotho、β-Klotho两种可溶性蛋白质[18]。其中β-Klotho(即KLB)是FGF19/21的高亲和力受体[19],FGF19/21通过与KLB结合发挥作用。近年研究发现KLB在糖、脂以及胆汁酸代谢过程中也发挥了重要作用[20]。有研究β-Klotho在妊娠期糖尿病孕妇妊娠中期的表达水平低于正常妊娠组[21],本研究结果提示在正常妊娠组和ICP组血清KLB表达水平呈增高趋势,但无统计学差异,与Tayyar等的研究结果一致,推测KLB在ICP发病机制中的作用还不明,需要扩大样本量作进一步研究。
本研究结果显示正常妊娠组和ICP组孕妇产时空腹血清FGF19和KLB蛋白的表达水平无差异,而血清中FGF21蛋白的表达水平在ICP组中显著增加,且血清中FGF21蛋白水平与AST、ALT、TBA、TG、KLB、分娩孕周具有相关性,其中TBA和TG是血清FGF21表达的独立影响因素。推测FGF21蛋白表达升高在ICP发病机制中所发挥的作用是一种代偿的保护机制,一定程度上可以反映病情严重程度,与TBA结合可以提高预测新生儿早产的特异性。
本研究也存在一定的不足,例如样本量较小,没有在孕期及产后对FGF19,FGF21及KLB进行动态监测从而发现三者在ICP发病中的变化规律等,在今后的工作中进一步研究。
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