生育力指女性每个排卵周期妊娠的可能性,换言之是指女性能够产生卵母细胞及卵母细胞受精并孕育胎儿的能力,正常育龄期女性在一个月经周期内受孕的可能性约为20%～25%[1]。据世界卫生组织发布的《不孕症患病率估计(1990—2021)》报告,在全球范围内,约17.5%的成年人(约1/6人口)受到不孕症的影响[2],且有增加的趋势,生育力下降已成为一个重要的全球公共卫生问题。中国育龄人口规模出现下滑,高龄女性生殖功能自然衰老退化、适龄女性病理性生殖衰老等问题日益突出,导致中国育龄人口生育力不断下降,不孕症患病率逐年升高,严重危及国内人口可持续发展,生育力下降面临着前所未有的挑战[3]。生殖系统最先发生衰老,卵巢衰老开始于30～35岁,明显早于其他器官衰老年龄。除了生理性卵巢衰老,卵巢微环境的氧化应激、卵母细胞减数分裂中断、颗粒细胞凋亡、黄体功能障碍等均可通过促进卵巢储备不足或耗竭加速,进而导致卵巢病理性衰老[4],不仅影响女性生育力,还会导致机体多系统受累,严重影响患者身心健康及生活质量[5-6]。
卵巢作为女性最重要的生殖器官,具备产生卵子并排卵的生殖功能,还可合成并分泌雌激素、孕激素、少量雄激素。卵巢储备功能减退(decreased ovarian reserve,DOR)是指卵巢内卵母细胞的数量减少和/或质量下降,同时伴有抗苗勒氏激素(anti-müllerian hormone,AMH)水平降低、窦卵泡计数(antral follicle counting,AFC)减少、促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)水平升高,临床可表现为月经初潮后到40岁前出现月经稀发、经量减少、渐至闭经以及生育能力减退或不孕,进一步可发展为早发性卵巢功能不全、卵巢早衰等,同时骨质疏松、骨折、心血管疾病、抑郁、认知功能障碍等疾病的发病率也随之增加,会给患者带来巨大的困扰[7]。卵巢衰老是一个多因素、多机制参与的病理生理过程,遗传变异、氧化应激、线粒体功能障碍、慢性炎症等都会通过影响卵巢储备及卵巢微环境导致DOR[8]。其中体内物质代谢异常是影响卵巢功能的一个重要原因,深入探究衰老导致生殖系统功能退化和疾病发生的原因,提前识别生殖系统疾病的风险因素,对生殖健康具有重要意义[9]。基于此,本综述将对DOR的代谢异常做系统性总结,并重点展开对比讨论,希望可以对DOR的诊断及治疗提供新思路。
一、DOR与基因表达
卵巢功能是由多因素、多机制参与调控的,针对遗传变异方面的探索已开展了很长时间。2001年,康奈尔大学首次利用微阵列技术描述了小鼠的卵泡发生基因表达谱[10];一项关注非编码RNA对小鼠卵巢作用的研究发现,miR-122-5p在原发性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency,POI)患者中显著升高,通过靶向BCL9可以诱导颗粒细胞凋亡,表明其可作为恢复卵巢功能的潜在靶点[11]。有研究通过对NOR/DOR患者的20个样本进行q-PCR检测,结果发现三种关键酶(PHGDH、PSAT1和PSPH)的蛋白水平在DOR年轻女性的卵丘细胞中上调,通过Western Blot分析进一步证实了这一结果[12]。在每个卵丘细胞样品中,与丝氨酸合成基因相关的mRNA表达水平和蛋白质含量之间存在显著相关性。已有研究数据表明在年轻DOR患者的卵丘细胞中,3-磷酸甘油酸参与丝氨酸合成的发生率上调[12],因此推测年轻DOR患者的卵巢功能下降与卵丘细胞中丝氨酸合成增加有关。另一项以20名患有DOR的年轻女性作为研究对象的队列进行了全外显子组测序(whole exome sequencing,WES)实验,获得了一组与DOR相关的基因突变,其中发现了GPR84和Y370H变异,该变异在促炎刺激下增强了卵巢颗粒细胞的炎症反应[13]。现有研究已表明慢性低级别炎症是卵巢早衰发病机制的主要因素,故推测卵巢颗粒细胞中GPR84的变异可能通过促进炎症的作用而影响卵巢储备功能,并成为非年龄相关性病理性DOR的潜在病因分子机制[14],结果或可作为开展DOR早期分子诊断和治疗靶点选择的初步研究基础。
二、DOR与肥胖
多项成果已证实肥胖是生育能力低下和生殖结果不理想的一个危险因素[15-16]。肥胖是一种慢性炎症状态,反映在全身炎症细胞因子水平的升高[17]、氧化应激标记物[18]和促炎症晚期糖基化终末产物[19]的含量变化,炎症环境的改变可能会对卵母细胞发育和排卵产生不利影响,这在一定程度上可以解释肥胖女性较差的生殖结果。研究发现与正常体重的女性相比,肥胖女性的颗粒细胞有异常的炎症和细胞周期中介基因表达[20]。在人类排卵过程中,单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)在排卵期卵泡液和卵巢基质细胞中的生理水平会短暂升高[21],以产生正常的排卵事件,而在肥胖者体内MCP-1水平在脂肪组织中异常升高,导致组织单核细胞的招募[22],从而导致慢性低级别炎症状态。还有研究以小鼠为研究对象,针对相关通路的基因进行了探讨,发现PEDF缺失导致小鼠卵巢氧化损伤并伴有DOR,与PEDF缺乏引起严重的胰岛素抵抗和脂质代谢紊乱有关。一方面,PEDF的缺失可以升高游离脂肪酸的水平,导致卵巢脂肪毒性和氧化应激的诱导;另一方面,PEDF缺乏可诱导胰岛素抵抗,使蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)去磷酸化,从而导致氧化应激,胰岛素抵抗和脂肪毒性相互促进,导致卵巢氧化损伤的发生[23]。因此,PEDF或可成为治疗卵巢氧化损伤相关疾病的潜在靶点。
基于此,肥胖是导致女性生育力低下的危险因素之一,也可作为研究DOR等疾病的治疗方向之一。
三、DOR与卵泡微环境代谢异常
卵泡液是卵母细胞与周围细胞交换物质和代谢能量的液体环境,其代谢产物的组成可以反映卵母细胞的代谢水平,检测卵泡液中代谢物的含量变化可以简便直观地反应卵巢微环境的变化,进而提示卵巢功能。卵泡液是由外周颗粒细胞和局部毛细血管弥散血清产生的分泌物及跨越滤泡屏障的血浆成分组成,主要成分是激素、生长因子、白细胞介素、抗凋亡因子、蛋白质、糖、氨基酸、活性氧和抗氧化酶等[24],能够影响卵母细胞成熟、卵泡壁破裂、受精和早期胚胎的发育[25]。氧化应激(oxidative stress,OS)是指机体内外受到刺激后产生过多活性氧(reactive oxygen species,ROS),超过机体抗氧化能力,导致机体氧化与抗氧化系统严重失衡、细胞和组织受到氧化应激损伤的现象[26]。近期研究发现,氧化应激可引起卵巢内分泌功能障碍、卵母细胞质量下降、颗粒细胞凋亡,进而导致卵泡闭锁,这对卵泡微环境、卵母细胞成熟、受精和胚胎发育都有显著影响[27]。卵泡液中的氧化应激标志物与卵母细胞的生长、发育和成熟密切相关,而卵泡液中相关代谢物的变化预示着卵母细胞的质量,由于DOR导致的不育一直是生殖医学中不可回避的问题,因此研究DOR患者卵泡液的代谢组学对于明确DOR致病机理、探索其治疗具有重要意义。
有文章以NOR/DOR女性为研究对象,探索了卵泡液中部分代谢物与卵巢功能之间的关系,研究结果发现DOR患者卵泡液内15种差异氧化脂质代谢物水平均低于对照组,基于京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)数据库发现这些脂质代谢物均与卵巢储备功能相关[28],因此推断与卵泡发育相关的DOR患者卵泡液中的脂质代谢障碍可能为促进卵母细胞成熟提供潜在的诊断和治疗靶点,此结果也为了解DOR患者卵母细胞发育环境、提高卵母细胞质量提供了科学依据[28]。有研究提出了通过监测动态脂质组改变进而评估人类健康、疾病、衰老的方法,结果表明多种不饱和脂肪酸会随年龄增长而减少,胆固醇酯、神经鞘磷脂、饱和脂肪酸、花生四烯酸等会随年龄增长而作用增强,揭示了脂质代谢与衰老的相关性[29]。
除脂质外,现在对于卵泡液内其他代谢物如氨基酸、蛋白质、酯类等物质都有相关研究。有文章提到骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP15)是一种TGF β样卵母细胞来源的生长因子,其参与卵巢卵泡发育,是颗粒细胞增殖和类固醇生成等过程的关键调节因子[30]。有研究以NOR/DOR女性为研究对象,发现DOR组有56个蛋白表达下调,88个蛋白表达上调,通过KEGG富集发现这些差异表达蛋白涉及多种代谢途径,主要与脂肪酸延伸、降解、代谢,烟酸和烟酰胺代谢,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解等有关[31]。毒理学研究认为邻苯二甲酸酯对人类生殖有毒害作用[31],不仅降低生育率,还通过抑制17- β -雌二醇的产生从而抑制窦卵泡生长,进而影响卵泡生成、产生卵巢功能障碍[32],影响卵母细胞成熟和胚胎发育。最新有文献报道了SIRT家族的赖氨酸脱酰酶与衰老间的关系,SIRT7是最新发现的一种SIRT的成员,通过对相关基因的调控进而提供抗衰老保护,SIRT下降则会破坏代谢稳态、加速衰老,因此,SIRT家族在未来也会成为研究衰老性疾病的关键物质[33]。
目前由于代谢组学的迅速发展与应用,越来越多的研究也聚焦于卵泡液中代谢物与卵巢功能之间的关系,这也为解决DOR问题提供了治疗靶点。
四、DOR与肠道菌群代谢异常
人体肠道内有大量的微生物群落,肠道微生物群被认为与人体健康密切相关,肠道菌群紊乱可导致生殖障碍疾病、内分泌疾病和心血管疾病等[34]。有报道称肠道菌群紊乱会破坏肠道黏膜屏障,致病菌及其代谢物通过血液循环到达卵巢,进而影响卵巢功能[35]。肠道菌群失调和微生物多样性降低会导致全身雌激素的改变[36],肠道细菌也会受到雌激素的影响。研究表明,两个细菌分类群Gammaproteobacteria类和Mixococcales未知家族的相对丰度与雌二醇(Estradiol,E2)水平正相关,而Prevotellaceae家族的丰度与E2水平负相关[37-38]。有一项以小鼠为研究对象的研究发现将幼年小鼠的肠道菌群移植到老年小鼠体内,可以促进老年小鼠卵巢卵泡发育,说明改善肠道菌群组成可以促进卵泡发育[39]。也有研究表明增加雌性小鼠肠道中Faecalibaculum、Bilophila和Anaerofustis的丰度可以促进卵泡发育[40],增加老年小鼠肠道中Bifidobacterium 和Ruminococcaceae的水平,卵巢颗粒细胞的增殖增加[39]。多项研究也发现肠道菌群及其代谢物可通过调节卵巢颗粒细胞的凋亡来影响卵泡发育[39,41]。
玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是最常见的非甾体真菌毒素之一,研究发现其化学结构与内源性雌激素相似,具有雌激素样作用,主要通过作用于体内雌激素受体引起生殖功能异常[42]。ZEN可以损害肠道形态,降低粘蛋白的表达[43],也会降低血清中溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine,LPC)水平,并影响卵巢储备[44]。通过采用高通量16S rRNA测序来鉴定ZEN诱导的肠道菌群变化,研究结果表明ZEN可以改变包括拟杆菌门、变形菌门、厚壁菌门和放线菌门在内的肠道菌群的组成与丰度。暗示了肠道菌群是ZEN毒性对卵巢发育的重要媒介[45]。
这些研究揭示了肠道微生物群与生殖系统疾病的潜在关联,同时也提示肠道微生物组的改变可能是卵巢功能相关疾病的发病机制之一,通过改善肠道菌群调节卵巢功能有望为卵巢衰老的诊疗提供新思路。
五、DOR与免疫稳态失调
DOR的病因包括遗传、医源性、感染性、代谢性和免疫性因素等,其中免疫性因素约占4%～30%[46],疾病相关抗体以及异常细胞免疫应答过程的存在,也表明了自身免疫机制参与患者的致病过程[47]。细胞因子作为卵泡微环境的关键成分,通过介导淋巴细胞的激活、卵泡生长、类固醇生成和炎症反应,被认为是卵巢功能的调节因子,免疫细胞及其分泌因子调控卵巢生殖干细胞在卵巢内的迁移和产生新的颗粒细胞与原始卵泡。此外,炎症在特发性病例和未知自身免疫病例中也被证实起到重要作用[48]。
目前关于卵巢损伤的几种免疫机制已被阐明,包括各种针对卵巢组织和自身免疫性疾病的抗体的产生[48-49]、T细胞亚群的改变和T细胞介导的损伤[49]、免疫抑制细胞数量的减少[50]等。细胞免疫功能障碍也被证实与卵巢生理有关,部分研究以小鼠作为研究对象,发现环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)诱导的POI小鼠模型中大量免疫细胞侵入卵巢组织[51],在胸腺切除诱导的POI小鼠中,T淋巴细胞比例失衡[52]。后有研究以POI患者作为研究对象,结果显示其外周血中CD4+/CD25+ Treg数量减少[53],提示卵巢功能受损对人体的免疫功能存在损害。也有研究以处于围绝经期的大鼠为研究对象,其卵巢储备功能有所下降但仍能生育,以此来模拟女性想生育但难以受孕的关键年龄。大鼠的RNA-seq结果表明,衰老卵巢内免疫细胞增加最显著的是Th1与Th17细胞,随着衰老,颗粒细胞将上调应激反应、免疫原性和纤维化信号通路,这也为卵巢功能与T淋巴细胞间影响关系提供了理论依据[54]。
随着免疫学研究的进展,对DOR的发病机制有了更多的了解,包括细胞因子水平和免疫细胞水平的改变,尤其是Treg细胞和Th17细胞水平的改变,将成为研究热点。
六、DOR的干预策略
辅酶Q10(coenzyme Q10,CoQ10)是一种内源性亲脂醌,具有抗氧化和生物能量的特性,这两种特性对衰老至关重要,在不同组织中,辅酶Q10的合成都会随着年龄的增长而减少,而人真皮成纤维细胞内Q10减少之后,会促进线粒体通透性转变和生物能量功能障碍,导致体外人类真皮成纤维细胞过早衰老,这也适用于其他组织衰老的机制[55]。在已有的体外模型以及动物和人类干预研究中,补充CoQ10已被证明可以有效地恢复衰老表型特征[56],近期有研究表明,补充CoQ10能够抵消衰老内皮细胞的氧化应激和炎症反应,并降低SASPs(senescence associated secretphenotype)基因的表达,通过保护线粒体结构和功能,诱导线粒体生物生成,进而起到延缓衰老、修复卵巢功能的作用[57],还有研究显示补充辅酶Q10可以通过增加Lachnospiraceae等益生菌的相对丰富进而保护肠道屏障,进而改善卵巢功能[58]。
烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)可用于治疗DOR,研究以自然衰老的小鼠为研究对象,发现经NMN治疗5个月后,其原始卵泡、原卵泡和次级卵泡数量均显著升高,提示NMN可维持中年小鼠卵巢储备[59]。P16是一种细胞周期依赖的激酶抑制剂,可阻止细胞周期从G1期向S期进展,其表达随年龄增加而增加,被认为是卵巢老化的指标之一,研究发现P16蛋白在包括卵母细胞和颗粒细胞在内的卵泡中高表达,给小鼠加NMN后可降低小鼠卵巢中P16的水平,提示NMN可能通过调节颗粒细胞中P16的表达来发挥抗衰老作用。同时有研究揭示了NMN通过恢复卵母细胞线粒体功能、减少ROS积累、DNA损伤和脂滴分布进而起到缓解DOR的作用[60-61]。故NMN对于在衰老过程中保证卵母细胞质量进而改善DOR患者生殖结果是有临床意义的。
脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)是肾上腺皮质分泌的一种雄激素,可促进性激素合成,维持性功能正常,改善卵子质量[62]。有研究针对DHEA对围绝经期大鼠卵巢储备变化、卵泡发育、生殖功能和妊娠结局的影响进行了研究,得出结论DHEA可以改善妊娠结局[63]。白藜芦醇(resveratrol,RES)是一种植物抗毒素,具有抗炎、抗氧化和免疫调节作用,现被证明具有雌激素活性[64],且对年龄相关的生育变化起保护作用,能够引起卵母细胞数量和质量的积极变化,并保持健康的卵泡数量[65]。一项研究发现经DHEA或RES处理后均可显著减少大鼠卵泡细胞的凋亡[66],进一步证实了DHEA和RES对卵巢功能的促进作用,肯定了其治疗效果。
褪黑素也可以作为缓解DOR的一种药物,通过干预AKT1、EGFR、MAPK1、HRAS、SRC等一系列靶点及生殖结构发育、上皮细胞增殖、外源性凋亡信号通路等生物学过程来改善卵巢储备功能,同时也具有抗衰老、抗凋亡、调节内分泌和免疫系统的作用[67]。除了这些药物,还有其他包括激素、中药、自噬激活剂、免疫调节剂等[68],均可通过不同的靶点及通路对卵巢功能进行调节,起到修复或重建卵巢储备功能的作用,机制有待后续研究。
除药物治疗外,有一些新型治疗方式被逐步发现,有研究提到输注骨髓干细胞(bone marrow-derived stem cells,BMDSC)可以供应足够的卵巢龛,维持或促进卵巢储备受损或衰老患者的卵泡挽救,BMDSC也可作为DOR患者卵巢再生和卵泡发育的替代选择[69]。有文献报道许多调控衰老的遗传与生化途径均控制着线粒体的生理功能,使得线粒体成为阐明环境对疾病影响的一个极好的载体,因此有许多预防和治疗DOR的研究聚焦于线粒体[70]。线粒体替代疗法是指将来自卵母细胞干细胞或其他类型细胞的线粒体移植到老化卵母细胞的细胞质中,用健康卵子中正常的线粒体补充和替换老化卵子中异常的线粒体,从而起到治疗的作用[71];除了线粒体替代疗法,还有线粒体基因编辑技术,通过基因编辑技术修复有缺陷的线粒体,这是一种更直接、更有效的治疗线粒体异质性的方法[72],但由于DOR等疾病的病因未明,且线粒体DNA突变复杂多样,因此限制了线粒体基因编辑技术在卵巢疾病治疗中的应用,这种治疗方法仍处于探索阶段。
七、结论
DOR是一种能够影响女性生育力的疾病,目前病因未明、起病隐匿、预防困难,且缺乏早期筛查标志物,故治疗效果有限,目前仍是不孕症临床治疗的巨大挑战之一。DOR不仅与患者的遗传基因相关,也与患者的免疫、肥胖、肠道菌群、卵泡液内代谢物等后天因素有关,可通过检测相关基因及筛查相关指标,通过其异常变化来反映卵巢功能是否正常,从而有助于对DOR的临床诊断及预后指导。近年来对DOR治疗的研究也呈现出多元化的特征,药物治疗包括辅酶Q10、烟酰胺单核苷酸、脱氢表雄酮、白藜芦醇、褪黑素等,非药物治疗则包括干细胞疗法、线粒体替代疗法、线粒体基因编辑技术等,希望可以实现早期干预并恢复DOR患者卵巢功能、精准靶向解决生育力下降的问题。
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