·论著·

昼夜节律紊乱促进子宫内膜癌进展的作用机制研究

赵乐 王朝霞 张三元

【摘要】 目的 探讨昼夜节律紊乱对子宫内膜癌节律基因CLOCK表达的影响及其参与疾病进展的可能机制。 方法 按照患者的年龄、孕产次、工作经历、教育信息及环境等背景匹配筛选出有夜班史的子宫内膜样腺癌6例为节律异常组,无夜班史6例为节律正常组,采用qPCR法、Western blot检测两组节律基因CLOCK mRNA及蛋白质的表达;应用免疫组化法检测32例子宫内膜癌组织中上皮-间质转化相关表型蛋白(E-cadherin、vimentin)及CLOCK蛋白的表达,并分析其与临床病理特征的关系,以及CLOCK表达与上皮间质转化表型蛋白的相关性。 结果 qPCR及Western blot结果显示CLOCK mRNA及蛋白在节律异常组子宫内膜癌中的相对表达水平明显低于对照组(P<0.05);免疫组化提示CLOCK阴性率和E-cadherin阴性率、vimentin阳性率在有夜班史、FIGO分期II-III期、深肌层浸润的肿瘤中更高,差异有统计学意义(P<0.05)。CLOCK表达和E-cadherin、vimentin的相关性具有统计学意义(P<0.05)。 结论 夜班造成的昼夜节律紊乱下调了子宫内膜癌组织中CLOCK基因的表达,节律基因CLOCK参与肿瘤组织上皮-间质转化过程是子宫内膜癌进展的可能机制,可能是影响预后的重要因素。

【关键词】 子宫内膜癌; 生物钟基因; 节律基因CLOCK; 上皮-间质转化

【中图分类号】 R71

基金项目：山西省基础研究自然科学研究面上项目(20210302123244)

作者单位：030001 太原,山西医科大学第一临床医学院妇产科(赵乐);山西医科大学第一医院妇科(张三元,王朝霞)

通信作者：王朝霞(13835181196@163.com)

The mechanism of circadian rhythm disruption promoting endometrial cancer progression

ZHAO Le, Wang Zhaoxia, Zhang Sanyuan. Department of Obstetrics and gynecology, The First Clinical Medical College of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001,China

[Abstract] Objective To explore the effect of circadian rhythm disruption on the expression of rhythm gene CLOCK in endometrial cancer and its possible promoting mechanism during the disease progression. Methods According to the patient′s age, gravidity and parity, occupational history, educational background, environmental factors, and other background matching, 6 cases of endometrioid adenocarcinoma with a history of night shift work were selected as the abnormal rhythm group, and 6 cases without a history of night shift work were selected as the normal rhythm group. qPCR and Western blot were used to detect the expression of CLOCK mRNA and protein in the two groups. Immunohistochemistry was used to detect the expression of CLOCK and epithelial-mesenchymal transformation related phenotypic proteins(E-cadherin and vimentin) in 32 cases of endometrioid adenocarcinoma, than analyzed the relationship between the expression and clinicopathological features, and the correlation between CLOCK expression and epithelial-mesenchymal transformation related phenotypic protein. Results The results of qPCR and Western blot showed that the relative expression levels of CLOCK mRNA and protein in abnormal rhythm group were significantly lower than those in normal rhythm group(P<0.05). Immunohistochemistry indicated that the negative rate of E-cadherin and CLOCK, the positive rate of vimentin were higher in the tumors with night shift work history, FIGO stage II-III and deep muscle infiltration, and the difference was statistically significant (P<0.05).The correlation between CLOCK expression and E-cadherin, vimentin in endometrioid adenocarcinoma tissue specimens was statistically significant, (P<0.05). Conclusion The disruption of circadian rhythm caused by night shift down-regulates the expression of CLOCK gene in endometrioid adenocarcinoma tissues. The involvement of CLOCK gene in epithelial-mesenchymal transformation process of tumor tissues is a possible mechanism of endometrioid adenocarcinoma progression and may be an important factor affecting prognosis.

[Key words] Endometrial carcinoma; Clock gene; Rhythm gene CLOCK; Epithelial-mesenchymal transition

为提高全社会生产效率,全球约五分之一的工人从事轮班工作,轮班工作导致激素紊乱、睡眠/觉醒周期错乱,对女性生殖健康造成严重威胁[1]。国际癌症研究机构也强调了夜间轮班工作与乳腺癌、结直肠癌等发病风险及卵巢癌的死亡风险升高相关,并将“夜班轮班工作”确定为对人类可能致癌(2A级证据)[2]。课题组前期研究发现,夜间轮班引起的节律异常与子宫内膜癌(endometrioid adenocarcinoma, EC)的生存预后相关,夜班史、夜班持续时间(≥5年)对内膜癌分期进展的影响具有统计学意义 [3]。

研究表明,由大脑/肌肉芳香烃受体核转运样蛋白1(brain and muscle ARNT-like protein 1, BMAL1)及昼夜运动输出周期蛋白(circadian locomotor output cycles kaput, CLOCK)构成的转录异二聚体复合物作为昼夜节律的核心正调控因子通过与启动子E-box序列结合,激活了周期昼夜节律调节因子(period circadian regulator, PER)及隐色素(Cryptochrome, CRY)的转录翻译,CRY/PER异二聚体的累积通过反向抑制BMAL1/ CLOCK活性降低自身转录水平共同构成生物钟核心转录翻译反馈环[4]。其中节律基因CLOCK的蛋白活性参与调节性激素合成进而影响内分泌激素相关组织,与卵巢癌、乳腺癌及前列腺癌中不受控制的细胞增殖有关[5]。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transformation,EMT) 是上皮细胞来源恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程,也是肿瘤复发及耐药关键[6]。本研究通过检测EC组织CLOCK基因及EMT相关表型蛋白(E-cadherin、vimentin)的表达,探讨夜班导致的昼夜节律紊乱对EC组织中节律基因表达的影响及其在肿瘤进展中的可能机制,以期为EC的治疗策略和预后评估提供一定的参考价值。

对象与方法

一、研究对象

收集山西医科大学第一医院妇科于2021年12月—2022年3月行手术切除的高分化子宫内膜样腺癌I期新鲜组织标本,取材后立即置于无酶EP管内,-80℃冰箱保存。根据病例的年龄、孕产次、工作经历、教育及环境等背景匹配,筛选出有夜班史EC标本6例为节律异常组,无夜班史6例为节律正常组;同时收集2021年8月—2021年12月行手术切除的子宫内膜癌石蜡组织32例,切片装盒备用。收集其临床病理资料包括年龄、夜班史、孕产次、淋巴结转移及FIGO分期等。夜间轮班的定义为23:00至次日7:00全时段内的工作,每月至少3次,持续≥3年[7]。

纳入标准:(1)术前未行放化疗等抗肿瘤治疗;(2)术后病理确诊为子宫内膜样腺癌;(3)从未从事过夜班轮班工作或既往夜班持续时间距首次确诊子宫内膜癌≤2年。排除标准:(1)自诉睡眠障碍者;(2)并发精神疾病的患者;(3)合并其他原发肿瘤。本研究经过山西医科大学第一医院伦理委员会审批,所有研究对象均签署知情同意书。

二、方法

1.qPCR:用RNA提取液提取新鲜组织标本总RNA,RT First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(Servicebio,武汉) 进行逆转录反应cDNA,超微量分光光度计( Thermo,美国) 检测RNA 浓度与纯度,采用2×SYBR Green qPCR Master Mix(None ROX)试剂( Servicebio,武汉) 配得PCR反应体系15 uL,扩增用CFX实时荧光定量PCR仪( Bio-Rad,美国)进行。以Folds =2-ΔΔCt方法计算组间相对表达倍数,以 GAPDH作为内参基因标定CLOCK mRNA的相对表达水平。CLOCK基因引物序列:上游5′-CAGAAGGGGAACATTCAGAGGTT-3′,下游5′-TAGGTAGATGGCTCCTTTGGGT-3;GAPDH基因引物序列:上 游 5′-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3′,下游 5′-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3。

2.Western blot检测:于冰上研磨新鲜组织标本,自动匀浆、充分裂解后,用BCA 试剂盒(碧云天,上海)测定蛋白浓度,取40 ug组织用SDS-PAGE试剂盒(Servicebio,武汉)进行凝胶电泳分离,湿转法转膜,用含5% 脱脂奶粉的TBST封闭液室温封闭2 h,一抗包括CLOCK(1:1 000稀释,武汉三鹰生物公司,#18094-1-AP)和GAPDH(1:1 000稀释,武汉三鹰生物公司,#GB15004),4 ℃下孵育过夜后,TBST充分洗涤PVDF膜5～6次,5min/次,HRP标记羊抗兔二抗(1:10 000稀释,Thermo,#NCI5079)37 ℃摇床孵育1 h,TBST充分洗涤PVDF膜5～6次,5min/次。经 ECL 显影、定影、曝光、扫描。

3.免疫组化:将收集石蜡组织常规切片、烤片、脱蜡、水化,加入免疫组化抗原修复缓冲液(基因科技,上海)高压修复2～3 min,非特异性反应阻断剂封闭抗原,滴加E-cadherin、vimentin及CLOCK一抗工作液,室温孵育1.5 h,PBST缓冲液冲洗3次,滴加酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物(二抗),37 ℃孵育30 min,PBST缓冲液冲洗3次,配置DAB工作液(稀释比1:1 000),室温显色10 min,冲洗后苏木素染液复染,常规封片。以PBS 代替一抗作为阴性对照,已知阳性切片作为阳性对照。

结果判定:E-cadherin、vimentin阳性着色于细胞质和(或)细胞膜中,CLOCK着色定位于细胞核内,以棕黄褐色为阳性表达。在染色均匀区域用高倍镜(200倍)随机采集3个视野,按阳性细胞百分比及染色强度确定结果。1.阳性细胞染色强度:棕褐色、棕黄、浅棕分别计3分、2分、1分;2.阳性细胞占比:>75%计4分,75%～51%计3分,50%～25%计2分,<25%计1分。总得分≥5为阳性表达,<5为阴性表达。

4.统计学分析:采用SPSS 26. 0软件进行统计学分析,计量数据以(均数±标准差)表示,组间比较采用独立样本t检验; 分类资料以n(%)表示,组间比较采用Fisher确切概率法,相关分析采用Spearman分析法,以P<0. 05 为差异有统计学意义。

结 果

一、两组EC组织中CLOCK基因mRNA表达量比较

节律异常组CLOCK基因mRNA相对表达量(0.24±0.02)低于对照组(1.00±0.08),差异有统计学意义(P<0.001,见图1A)。

****P<0.0001,***P<0.001
A.qPCR was used to detect the relative expression of CLOCK mRNA in control group and shift group. B.The expression of CLOCK protein in control group and shift group was detected by Western blot
图1 CLOCK基因在对照组及节律异常组EC中的表达情况
Figure 1 Expression of CLOCK gene inendometrioid adenocarcinoma of control group and shift group

二、两组EC组织中CLOCK蛋白表达量比较

节律异常组CLOCK蛋白表达量(0.62±0.05) 较对照组(0.96±0.04) 降低,差异有统计学意义(P<0. 001),见图1B。

三、EC组织中CLOCK及E-cadherin、vimentin的表达与临床病理参数的关系

免疫组化结果见图2。在有夜班史的EC组织中vimentin阳性率76.9%(10/13)、E-cadherin阴性率84.6%(11/13),均高于无夜班组31.6%(6/19)、36.8%(7/19),见表1;vimentin阳性率及E-cadherin阴性率在FIGO分期II-III期组中均为78.6%(11/14),均高于I期组27.8%(5/18)、38.9%(7/18);在深肌层浸润组分别为81.8%(9/11)、90.9%(10/11),均高于浅肌层浸润组33.3%(7/21)、38.1%(8/21);各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05),见表2。

表1 EC组织中E-cadherin、vimentin及CLOCK的表达与夜班史的关系[例(%)]
Table 1 Relationship between the expression of E-cadherin, vimentin and CLOCK and night shift history in endometrioid adenocarcinoma[n(%)]

ProteinsExpressionnWith night shift work history Without night shift work historyPVimentin+1610(76.9)6(31.6)-163(23.1)13(68.4)0.029E-cadherin+142(15.4)12(63.2)-1811(84.6)7(36.8)0.012CLOCK+205(38.5)15(78.9)-128(61.5)4(21.1)0.030

表2 EC组织中E-cadherin、vimentin及CLOCK表达与临床病理特征关系
Table 2 Relationship between expression of E-cadherin, vimentin, CLOCK and clinicopathological features of patients with endometrial adenocarcinoma

VariablenVimentin+-PE-cadherin+-PCLOCK+-PAge≤501174>50219120.458658130.4659211100.139FIGO stageI18513II-III141130.0111173110.036153590.010Muscle infiltration≤1/221714>1/211920.0231381100.008174380.006Lymphatic metastasisNo241014Yes8620.220915530.252168440.433

A.Expression of vimentin in normal endometrium; B.Low expression of vimentin in endometrial carcinoma; C. High expression of vimentin in endometrial carcinoma. D.Expression of E-cadherin in normal endometrium. E.High expression of E-cadherin in endometrial carcinoma. F.Low expression of E-cadherin in endometrial carcinoma;G.Expression of CLOCK in normal endometrium. H.High expression of CLOCK in endometrial carcinoma. I.Low expression of CLOCK in endometrial carcinoma
图2 vimentin、E-cadherin、CLOCK在正常子宫内膜及EC中表达(IHC×100)
Figure 2 Expression of vimentin, E-cadherin and CLOCK in normal endometrial and endometrioid adenocarcinoma(IHC×100)

有夜班史的EC组织中CLOCK阴性率61.5%(8/12),高于无夜班史21.1%(4/12),见表1;CLOCK阴性率在FIGO分期II-III期组为64.3%(9/14),高于I期组16.7%(3/18);在深肌层浸润组72.7%(8/11),高于浅肌层浸润组19.0%(4/21),各组间差异均有计学意义(P<0.05),见表2。vimentin、E-cadherin及CLOCK的表达与患者的年龄及淋巴结转移均无统计学相关(P>0.05),见表2。

四、EC组织中CLOCK与E-cadherin、vimentin表达的相关性分析

癌组织标本中CLOCK阳性表达和E-cadherin、vimentin的相关系数分别为0.683、0.775,关联具有统计学意义(P<0.05)。

讨 论

哺乳动物的昼夜节律系统由位于下丘脑视交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)的中央起搏器及外周振荡器组成,并通过SCN与外周靶组织间的神经网络连接、SCN驱动的内分泌节律(如皮质醇和褪黑激素分泌)、周期性行为(进食/禁食、睡眠/觉醒等)及其相关生理变化的同步振荡网络形成24小时生物钟[8]。研究发现夜间轮班、空乘行业的长期时差影响、长期的夜间光线暴露等行为及环境变化将引起昼夜节律紊乱,导致激素分泌失调、代谢综合征,增加肿瘤形成及进展风险,尤其是乳腺癌、前列腺癌及卵巢癌等内分泌相关肿瘤[9]。Lozano-Lorca等[10]研究发现夜班工作与前列腺癌发病风险显著关联;大量病例对照研究及对护士健康的队列研究都提供了夜班工作与乳腺癌风险相关的有力证据[11-12];近期一篇分析妇科肿瘤与夜班工作的系统性评价[13]还显示了夜班工作与浸润性卵巢癌的发病及死亡风险升高相关、夜间轮岗护士患子宫内膜癌的风险增加。

然而,昼夜节律调控依赖于BMAL1/ CLOCK转录激活复合物及CRY、PER转录抑制因子构成的核心转录翻译反馈环,并受到NR1D1/2、ROR核受体及各种蛋白激酶的调控,其中BMAL1/ CLOCK复合物通过与靶基因启动子E-box序列结合激活其他时钟控制基因的节律性表达[5],是形成节律性生物过程的关键。节律基因的失调通过对肿瘤细胞、免疫细胞及肿瘤微环境的内分泌代谢作用调控肿瘤的增殖、侵袭并介导肿瘤免疫逃逸,与肿瘤进展、复发及治疗耐药密切相关[14]。此外,与内源昼夜节律长期不同步的错乱睡眠可导致BMAL1、CLOCK核心调控基因的转录水平从6.4%减少到1%[15]。研究表明CLOCK核心基因在前列腺癌中表达下调,增加CLOCK表达后可使肿瘤细胞中被解除调控的核心节律重新同步,有利于肿瘤预后[16]。Sanford等[17]发现在白血病中CLOCK低表达,CLOCK可作为鉴别白血病和预测追踪治疗效果的生物标志物。

子宫内膜是受激素周期调节而动态变化的组织,长期夜间轮班工作破坏正常睡眠周期并导致性激素分泌紊乱[18],是引起子宫内膜病理变化的原因之一;昼夜节律紊乱还可能增加肿瘤微环境中炎性因子水平和免疫抑制表型,诱导肿瘤细胞激活EMT程序并促进疾病进展,其机制尚不明确[9]。EMT过程以E-cadherin介导的细胞粘附力降低及vimentin介导的细胞骨架整合作用增强为显著特征,是促进肿瘤细胞迁移侵袭及复发耐药的重要驱动力[19]。本研究结果显示,在有夜班史的子宫内膜样腺癌组织中CLOCK mRNA及蛋白表达明显降低,提示夜班引起的昼夜节律导致了节律基因CLOCK差异表达;进一步通过检测EC组织中CLOCK及EMT相关表型蛋白发现,与之前的结果一致,相比无夜班史,有夜班史的EC组织CLOCK阳性表达率更低;E-cadherin阴性率及vimentin的阳性率更高,分别为84.6%、76.9%,组间比较差异有统计学意义;E-cadherin、vimentin和CLOCK的表达还与FIGO分期及是否存在肌层浸润有关(P<0.05);进一步的相关分析提示癌组织中CLOCK阳性表达和E-cadherin、vimentin的关联性具有统计学差异。综上所述,夜班引起的昼夜节律紊乱不仅导致EC组织中节律基因CLOCK的差异性表达,还可能参与肿瘤组织EMT生物学过程,是EC进展、转移的可能机制之一。CLOCK低表达是否促进EC组织发生EMT尚需深入研究,课题组后续将进一步验证夜班引起的昼夜节律失调在EC进展中的分子机制,以期对患者的早期个体治疗、预后判断和开展靶向治疗提供一定理论依据。

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(收稿日期：2023-02-08)