·综述·
子痫前期(pre-eclampsia,PE)是一种妊娠相关疾病,以妊娠20周后新发高血压和蛋白尿为特征,常伴有肝功能、肾功能、循环系统以及中枢神经系统的异常变化,是孕产妇及围产儿死亡的主要原因之一,PE的临床治疗仅限于对症治疗或终止妊娠[1]。导致PE的发病过程可能是单一因素或多种因素参与,目前普遍认可的观点主要是妊娠早期滋养细胞浸润不良导致子宫螺旋小动脉再灌注功能障碍和胎盘浅着床,同时也伴随氧化应激、血管因子生成失衡、内皮功能减退、代谢变化、血栓形成、过度炎症反应等。
HtrA(high-temperature requirement A)系丝氨酸蛋白酶家族,已在众多哺乳动物中鉴定出四种HtrA同源物(HtrA1～4),HtrA在正常和应激条件下发挥作用,参与细胞死亡、细胞信号和运动的调节、维持线粒体稳态、胚胎植入等,会导致多种病理过程,如多种癌症、神经退行性疾病、关节炎和生殖障碍[2]。HtrA1～3广泛表达于心脏、平滑肌、乳房和发育中的胎盘等,相比之下HtrA4相对局限表达于胎盘组织[3]。以往研究发现在PE孕妇的胎盘中及血液循环HtrA4存在差异表达,所以推测此种蛋白可能在PE发生过程中具有重要作用,但主要的病理生理机制尚不明确。近年来HtrA4对滋养细胞及血管内皮方面的相关机制被广泛研究,现对HtrA4与PE的研究进展进行综述。
1.HtrA4分子结构:HtrA4最初被鉴定为与妊娠相关的丝氨酸蛋白酶,该基因位于染色体8p11.22上,包含9个外显子,编码476个氨基酸,大小约为50 kDa。全长HtrA4由一个信号肽、一个IGFBP结构域、一个Kazal样结构域、一个丝氨酸蛋白酶结构域SPD和一个PDZ结构域组成[3]。HtrA4的功能需要变构调节是一个复杂的分子间相互作用网络。HtrA4在细胞中的作用取决于它的蛋白酶活性、N端结构域以及C端PDZ结构域。IGFBD结构域和Kazal样结构域的串联N端含有分泌蛋白的信号肽特征,在HtrA4寡聚反应中起到重要作用[3]。高度保守的C端PDZ结构域可能为蛋白酶提供更多构象灵活性,从而积极影响蛋白酶活性,用于调节蛋白质之间的相互作用,关于SPD结构域包含12条β链,由进化保守的环连接,这些环在激活过程中有着重要的作用[2]。
2.HtrA4组织定位及表达:以往研究提出只有胎盘表达HtrA4的观点,但近年发现,HtrA4在胶质母细胞瘤、乳腺癌和前列腺癌等癌症中表达也发生了改变[3],Liu等人敲除了小鼠的HtrA4基因,胚胎和胎盘在结构和形态上并未见明显异常,推测HtrA4只在人类胎盘的特定表达过程中发挥重要作用[4]。此外,在正常绒毛中,HtrA4蛋白在细胞滋养细胞的细胞质中比在合体滋养细胞中更丰富,而在PE的胎盘中,合体滋养细胞中HtrA4蛋白的量显著增加[5]。
以往的研究虽缺乏HtrA4参与PE具体病理机制的阐述,但实验结果发现,相较正常妊娠孕妇,HtrA4在胎盘和血液循环中的表达水平在PE患者中明显增高,在早发性PE患者中尤其明显[6-7]。HtrA4的表达与新生儿出生体重呈负相关性,与脐血流循环阻力相关的胎儿脐动脉收缩压与舒张压的比值(S/D)、搏动指数(PI)、阻力指数(RI)呈正相关[6-7],以上指标都提示胎盘组织中HtrA4的过高表达可能导致胎盘低灌注,脐血流循环阻力增加,进一步影响了胎儿的生长发育。HtrA4是否通过某种机制导致胎盘循环阻力增加进而参与PE发病,现缺乏关于其中具体病理机制的研究。
此外,血液循环中的HtrA4高水平与妊娠不良结局相关,是PE发生的危险因素[8]。近年Wang等[9]发现高水平的HtrA4会改变血管生成、血管活性、血小板活化和细胞粘附、凝血、凋亡等重要的基因的表达,可能PE孕妇血液循环中的HtrA4是内皮功能障碍的潜在原因,且在早发性PE血液循环中检测到的高水平HtrA4会诱导促进炎症,显著增加了促炎基因白介素-1(interleukin-1,IL1)、白介素-6(interleukin-6,IL6)和环氧合酶(cyclooxygenase2,COX2)的表达。也有研究表明,PE孕妇血液循环中HtrA4升高还会改变有关衰老基因的表达,导致内皮细胞过早老化,从而增加孕妇晚年患心血管疾病的风险[10]。
所以无论是胎盘或是血液循环中过高水平的HtrA4,都可能参与PE的发生发展,且与妊娠结局及预后密切相关。
1.抑制血管生成,破坏内皮细胞屏障:内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是血液循环中独特的细胞群,在内皮损伤时被募集到内皮,然后分化为常驻内皮细胞,以再生血管并恢复内皮功能,具有很高的血管生成潜能[11]。EPCs在内皮细胞修复及正常妊娠中发挥重要作用,从PE的脐带血中分离的EPC的增殖受损,造成其数量减少且功能减退,但尚不清楚其中机制[12],在Wang等[13]的研究中发现HtrA4显著抑制了从人脐带血中分离EPC的增殖,并阻碍其分化为成熟内皮细胞。PE血液循环中高水平的HtrA4可能通过抑制EPC增殖和分化损害内皮细胞功能。该研究分别用1.5 ug/mL 和3.0 ug/mL(在早发性PE血清中检测到HtrA4的中位水平和最高水平)的HtrA4处理脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),经3.0 μg/mL处理的HtrA4显著抑制内皮细胞增殖,但在抑制增殖的同时并未诱导内皮细胞死亡。进一步发现经过3.0 ug/mL HtrA4处理48 h后四个参与细胞周期增殖及调节的基因表达受到明显的抑制,分别是参与细胞周期G1和S期的CDKN3、参与细胞周期的G2和M期BIRC5、参与细胞周期检查点的CDK1以及细胞增殖和细胞周期调节所必需的MKI67[13],这些基因被抑制可能阻止了内皮细胞的增殖,抑制了血管的生成。
研究发现HtrA4对血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor -A,VEGF-A)也有影响,VEGF-A是血管生成的关键调节因子,VEGF-A会结合并激活2个酪氨酸激酶受体:FMS样酪氨酸激酶-1(FMS-like tyrosine kinase-1,Flt-1)和激酶域受体(KDR),介导内皮细胞的增殖、迁移和通透性等病理生理过程[14-15]。研究发现经过高浓度HtrA4(3.0 mg/mL)处理HUVEC会显著降低启动下游细胞内信号传导(如Akt磷酸化),降低KDR水平,从而破坏VEGF-A诱导血管生成过程,导致血管生成障碍[16],这可能解释了为什么血液循环中HtrA4升高会对全身内皮产生影响,而且增加血液循环中VEGF-A可能不仅需要改变Flt-1水平,提升KDR水平也同样重要,这表明HtrA4对KDR的影响有望成为未来治疗PE的潜在靶点。
另外,VE钙粘蛋白(VE-cadherin,VE-cad)是在内皮细胞表达的一种关键的粘附连接蛋白,控制内皮细胞接触和血管通透,其被破坏也是参与PE血管内皮损伤的一个环节[17-18],Tseng等[19]发现HtrA4的高表达可能通过切割VE-cad而破坏细胞连接导致内皮屏障破坏进而参与PE的发生发展。总之,抑制血管内皮生成、破坏血管屏障这些与PE相关的过程均与HtrA4的高表达密切相关。
2.HtrA4通过降解抗凋亡蛋白促进细胞凋亡:Wenta等[20]的研究表明,HtrA4可以与β-微管蛋白、肌动蛋白、抗凋亡蛋白(XIAP)和半胱氨酸蛋白酶7形成复合蛋白,并降解这些蛋白,由此推测HtrA4可能参与了细胞凋亡过程。后在肺癌和乳腺癌细胞系中也有此发现,HtrA4会降低细胞XIAP、β-微管蛋白、肌动蛋白和半胱氨酸蛋白酶7的水平,但进一步发现 HtrA4的过度表达只会诱导XIAP降解,但不会直接诱导细胞凋亡[21]。这些结果表明,HtrA4可能通过降解抗凋亡XIAP和细胞骨架结构蛋白参与细胞凋亡,这种机制是否在PE中发挥关键作用需要进行进一步研究。
3.HtrA4对滋养细胞的调节作用:胎盘的最外层由合体滋养细胞构成,它通过下层的细胞滋养细胞进行细胞融合,给予胎儿充足的氧气及营养物质供应。早发性PE主要与胎盘早期滋养层侵袭不足相关,扰乱合体滋养细胞的形成会导致胎盘低灌注,会导致妊娠后期胎盘缺血和胎儿血供减少。近年的研究结果发现HtrA4对滋养细胞的调节作用主要在两方面,一是对滋养细胞的侵袭的影响,另一是对细胞滋养层合胞的影响。
HtrA4对滋养细胞侵袭作用的研究结果存在矛盾,一项研究发现HtrA4的表达抑制滋养细胞侵袭和生长[22],而在另一项研究中HtrA4促进滋养层细胞侵袭[23],近年Mansilla等人[24]也发现在BeWo细胞中,内源性HtrA4被敲低时细胞的侵袭性会降低,后又应用BeWo细胞模拟滋养层细胞融合的模型发现细胞融合过程中HtrA4的显著上调,敲除HtrA4的BeWo细胞明显不能融合,由此推测HtrA4的缺失可能会抑制滋养细胞合胞化。此外,与细胞滋养层细胞相比,合体滋养细胞表达高水平的合胞蛋白-1(syncytin-1),Syncytin-1的低表达会导致合胞结构受损以及功能缺陷[25],以往已有多个研究发现HtrA4在PE中呈高表达,同时Syncytin-1呈低表达,二者呈负相关[7,26],这些结果表明HtrA4可能在细胞滋养层细胞合胞过程中起着重要作用,或许一个特定的HtrA4水平才能维持正常细胞滋养层细胞合胞和滋养细胞侵袭,具体机制还需进一步的研究深入探索。
4.缺氧上调HtrA4的表达:胎盘中低氧诱导的转录因子和基因特异性表达是导致PE发病的核心因素,有研究证实了缺氧与HtrA4的相关性。徐晓敏等通过低氧细胞模型实验证实,缺氧可诱导滋养细胞HtrA4表达上调,激动或抑制低氧条件下显示HtrA4的表达与乏氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表达水平相关,且部分受HIF-1α调控[27]。此外,Liu等[22]对滋养细胞进行低氧处理,后通过RT-qPCR和western印迹测定HtrA4的表达,发现滋养细胞中HtrA4呈现高表达状态,而且缺氧处理后的滋养细胞侵袭能力明显受损。HtrA4在PE中过度表达是胎盘缺氧或异常细胞因子表达的主要步骤还是继发结果尚不完全清楚,HIF-1α诱导表达HtrA4的具体机制也有待于深入研究,阐明HIF-1α与HtrA4表达的关系有助于了解HtrA4在氧化应激中发挥的作用,以期确定HtrA4是PE发病过程中的关键标志物。
综上所述,HtrA4在正常妊娠与PE之间的差异表达可能代表疾病状态,成为滋养细胞融合侵袭障碍和血管内皮损伤的有效标志物。虽然关于HtrA4参与PE的机制已有一定的理论及实验基础,但仍缺乏深入的研究及验证,例如关于HtrA4的表达水平与S/D、PI、RI呈正相关,推测其是否与PE的严重程度相关。另外,HtrA4参与胎盘氧化应激的具体机制的相关研究也非常有限,需要对HtrA4进行更多的研究证实以及更大样本量的统计分析。现国内对HtrA4参与PE的具体机制并未开展大量研究,HtrA4对滋养细胞的作用及血管内皮功能的影响也需要更多的研究来证明。总之,HtrA4可能通过多种机制影响PE的发病及预后,未来在PE诊疗中有着广阔的探索空间和发展前景,这种蛋白酶可能会为PE的症状诊断、治疗和预后提供潜在的新靶点。
1 Tlaye KG,Endalfer ML,Kassaw MW,et al.Preeclampsia management modalities and perinatal death:a retrospective study in Woldia general hospital.BMC Pregnancy Childbirth,2020,20:205.
2 Zurawa-Janicka D,Wenta T,Jarzab M,et al.Structural insights into the activation mechanisms of human HtrA serine proteases.Arch Biochem Biophys,2017,621:6-23.
3 Kummari R,Dutta S,Chaganti LK,et al.Discerning the mechanism of action of HtrA4:a serine protease implicated in the cell death pathway.Biochem J,2019,476:1445-1463.
4 Liu J,Li Y,Hoh J.Generation and characterization of mice with a conditional null allele of the HtrA4 gene.Mol Med Rep,2015,12:6768-6774.
5 Inagaki A,Nishizawa H,Ota S,et al.Upregulation of HtrA4 in the placentas of patients with severe pre-eclampsia.Placenta,2012,33:919-926.
6 李发红,韩娜,江楠,等.重度子痫前期患者胎盘组织HtrA4表达与围产结局.中国计划生育学杂志,2020,28:1125-1128.
7 孔红芳,王芳,王凤暖,等.子痫前期患者母血及胎盘组织中HtrA4、Syncytin-1的表达及意义.现代妇产科进展,2017,26:5-10.
8 齐鑫,马凌花,耿霞.ACR值母血HtrA4水平与妊娠期高血压疾病患者不良妊娠结局的关系研究.中国妇幼保健,2020,35:4218-4220.
9 Wang Y,Nie G.High levels of HtrA4 observed in preeclamptic circulation drastically alter endothelial gene expression and induce inflammation in human umbilical vein endothelial cells.Placenta,2016,47:46-55.
10 Wang Y,Lim R,Nie G.Elevated circulating HtrA4 in preeclampsia may alter endothelial expression of senescence genes.Placenta,2020,90:71-81.
11 Steiner D,Reinhardt L,Fischer L,et al.Impact of endothelial progenitor cells in the vascularization of osteogenic scaffolds.Cells,2022,11:926.
12 Brodowski L,Schröder-Heurich B,von Hardenberg S,et al.MicroRNA profiles of maternal and neonatal endothelial progenitor cells in preeclampsia.Int J Mol Sci,2021,22:5320.
13 Wang Y,Lim R,Nie G.HtrA4 may play a major role in inhibiting endothelial repair in pregnancy complication preeclampsia.Sci Rep,2019,9:2728.
14 Roskoski R Jr.Vascular endothelial growth factor(VEGF) and VEGF receptor inhibitors in the treatment of renal cell carcinomas.Pharmacol Res,2017,120:116-132.
15 Xiao Z,Li S,Yu Y,et al.VEGF-A regulates sFlt-1 production in trophoblasts through both Flt-1 and KDR receptors.Mol Cell Biochem,2018,449:1-8.
16 Wang Y,La M,Pham T,et al.High levels of HtrA4 detected in preeclamptic circulation may disrupt endothelial cell function by cleaving the main VEGFA receptor KDR.FASEB J,2019,33:5058-5066.
17 Pang V,Bates DO,Leach L.Regulation of human feto-placental endothelial barrier integrity by vascular endothelial growth factors:competitive interplay between VEGF-A(165)a,VEGF-A(165)b,PIGF and VE-cadherin.Clin Sci(Lond),2017,131:2763-2775.
18 Sung DC,Chen X,Chen M,et al.VE-cadherin enables trophoblast endovascular invasion and spiral artery remodeling during placental development.Elife,2022,11:e77241.
19 Tseng E,Yee Teoh SS,Wang Y,et al.Elevated protease HtrA4 in the maternal circulation of preeclampsia may contribute to endothelial barrier disruption by cleaving key junctional protein VE-cadherin.Placenta,2019,76:51-53.
20 Wenta T,Jarzab M,Rychlowski M,et al.Cellular substrates and pro-apoptotic function of the human HtrA4 protease.J Proteomics,2019,209:103505.
21 Wenta T,Rychlowski M,Jarzab M,et al.HtrA4 protease promotes chemotherapeutic-dependent cancer cell death.Cells,2019,8:1112.
22 Liu C,Xing F,He Y,et al.Elevated HTRA1 and HTRA4 in severe preeclampsia and their roles in trophoblast functions.Mol Med Rep,2018,18:2937-2944.
23 Wang LJ,Cheong ML,Lee YS,et al.High-temperature requirement protein A4(HtrA4) suppresses the fusogenic activity of syncytin-1 and promotes trophoblast invasion.Mol Cell Biol,2012,32:3707-3717.
24 Mansilla M,Wang Y,Lim R,et al.HtrA4 is up-regulated during trophoblast syncytialization and BeWo cells fail to syncytialize without HtrA4.Sci Rep,2021,11:14363.
25 Malhotra SS,Banerjee P,Chaudhary P,et al.Relevance of Wnt10b and activation of β-catenin/GCMa/syncytin-1 pathway in BeWo cell fusion.Am J Reprod Immunol,2017,78.
26 史英华.Syncytin-1和HtrA4在子痫前期患者母血及胎盘组织中的表达及临床意义.中国妇幼保健,2018,33:1244-1247.
27 徐晓敏,汪文寰,孙聪聪,等.HtrA4在子痫前期孕妇胎盘组织中的表达及与滋养细胞缺氧的相关性.浙江医学,2021,43:516-520,536.