子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)是临床常见慢性妇科疾病,总患病率为18%,是引起女性痛经、月经异常、不孕的主要病因,还能引起抑郁和焦虑等精神疾病,严重影响女性身心健康[1-2]。EMs可侵犯全身任何部位,且以卵巢为主[3]。越来越多证据显示,EMs会增加卵巢癌患病风险[4-5]。尽早检出并给予有效治疗对改善患者预后具有重要临床意义。近年研究发现,微小RNA在卵巢子宫内膜异位症(ovarian endometriosis,OEMs)、卵巢癌等发生发展过程中发挥重要作用[6-7]。微小RNA-205(microRNA-205,miR-205)是一种重要的微小RNA分子,有证据表明,miR-205在上皮性卵巢癌中显著下调,在上皮性卵巢癌诊断方面具有一定潜力[8]。且有研究发现,OEMs患者异位内膜组织中miR-205表达明显下调,与OEMs的发生发展密切相关[9]。但miR205与体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)妊娠结局的关系尚无研究报道,且内膜组织中miR-205表达水平检测操作复杂,临床应用存在一定局限性。基于以上研究,本研究进一步探究血清miR-205在OEMs中的作用及与IVF-ET妊娠结局关系,以期为临床评估OEMs病情、预测IVF-ET妊娠结局提供重要参考。
对象与方法
1.研究对象:选取2021年11月—2022年6月石家庄市人民医院100例OEMs患者作为OEMs组,纳入标准为(1)符合OEMs诊断标准[10];(2)尚未接受相关治疗;(3)有生育需求;(4)已签署同意书。根据2∶1对照原则,另随机选取同期、同年龄段50例体检正常的育龄女性作为体检正常组,纳入标准为身体健康、无子宫及附件疾病、已签署同意书。两组排除标准为(1)有生殖系统手术史;(2)其他疾病所致不孕;(3)精神疾病或心理障碍;(4)血液系统疾病;(5)严重内科疾病或外科疾病。
2.方法:
(1)血清指标检测。所有研究对象均于入院时采集空腹静脉血3 mL,离心处理(半径8 cm,转速3 500 r/min,时间5 min)取血清,采用实时荧光聚合酶链式反应检测血清miR-205水平,试剂盒购自德国Qiagen公司,qRT-PCR仪购自上海土森视觉科技有限公司,以U6为内参。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成,miR-205上游引物:5′-ACACTCCAGCTGGGTCCTTCATTCC-3′,下游引物:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAG TTGAGCAGACT-3′。U6上游引物:5′-CTCGCTTCGG CAGCACATATACTA-3′,下游引物:5′-ACGAATTTGC GTGTCATCCT TGC-3′。应用公式2-ΔΔct计算miR-205相对表达水平。采用酶联免疫吸附法(试剂盒厂家:上海江莱生物)检测血清OEMs传统标志物水平,包括血清糖类抗原125(CA125)、血管内皮生长因子(vascular epithelial growth factor,VEGF)、抗子宫内膜抗体(anti-endometria antibody,EMAb)水平。以上检测操作均由专业人员严格按照试剂盒说明书完成。
(2)IVF-ET方法。OEMs组均行IVF-ET,由同一组医生严格按照《人类体外受精-胚胎移植实验室操作专家共识(2016)》[11]中操作规范进行IVF-ET,移植后第35天通过超声评估是否临床妊娠。
(3)饮酒、吸烟定义。饮酒定义:每日饮白酒≥2两或啤酒≥2瓶,每周饮酒≥1次;吸烟定义:每天抽烟≥1支,连续吸烟时间>6个月。
3.观察指标:
(1)两组基础资料、血清miR-205、OEMs传统标志物(CA125、VEGF、EMAb)水平。
(2)OEMs组不同临床特征[美国生育学会修正EM分期(the revised American Fertility Society classification,r-AFS)[12]、子宫内膜情况、疾病类型]患者血清miR-205水平。
(3)OEMs组成功妊娠与未成功妊娠患者入院时血清miR-205、OEMs传统标志物(CA125、VEGF、EMAb)水平。
4.统计学处理:采用SPSS 22.0软件。计数资料以例(%)描述χ2检验。计量资料以K-S法检验符合正态分布,以
描述、t检验,多组间比较采用单因素方差分析,两两组间比较采用SNK-q检验。采用Pearson相关系数分析研究组血清miR-205水平与OEMs传统标志物水平的相关性,采用Spearman相关系数分析研究组血清miR-205水平与OEMs患者临床特征的相关性。采用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析入院时血清miR-205、OEMs传统标志物水平预测IVF-ET妊娠结局的价值,不同预测方案的曲线下面积(area under the curve,AUC)比较采用DeLong检验,并采用净重新分类指数(net reclassification improvement,NRI)、综合判别改善指数(inte-grated discrimination improvement,IDI)评价不同预测方案的预测能力。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1.两组基础资料、血清miR-205、OEMs传统标志物水平比较:两组年龄、体质指数、吸烟、饮酒等基础资料对比差异无统计学意义;OEMs组血清miR-205水平低于体检正常组,血清CA125、VEGF、EMAb水平高于体检正常组,差异均有统计学意义。见表1。
表1 两组基础资料、血清miR-205、OEMs传统标志物水平比较
与体检正常组比较,*P<0.05
组别n年龄(岁)体质指数(kg/m2)吸烟饮酒miR-205CA125(kU/L)VEGF(ng/L)EMAb(ng/L)OEMs组10035.2±2.322.67±1.623(23.0)16(16.0)0.93±0.26∗952.34±120.86∗798.32±97.61∗0.41±0.12∗体检正常组5034.5±2.122.37±1.89(18.0)4(8.0)1.85±0.38432.59±81.46 418.94±65.300.24±0.07
2.不同临床特征患者血清miR-205水平比较:OEMs组不同年龄、子宫内膜情况、疾病类型患者血清miR-205水平比较,差异无统计学意义;不同r-AFS患者血清miR-205水平比较,差异有统计学意义,随着r-AFS增加,血清miR-205水平明显降低。见表2。
表2 不同临床特征患者血清miR-205水平比较
与Ⅰ期比较,aP<0.05;与Ⅱ期比较,bP<0.05;与Ⅲ期比较,cP<0.05
临床特征例(%)miR-205年龄(岁) <3542(42.0)0.92±0.21 ≥3558(58.0)0.94±0.24r-AFS Ⅰ期18(18.0)1.24±0.22 Ⅱ期26(26.0)0.98±0.20a Ⅲ期35(35.0)0.87±0.19ab Ⅳ期21(21.0)0.70±0.16abc疾病类型 卵巢型28(28.0)0.91±0.21 腹膜型34(34.0)0.95±0.24 深部浸润型38(38.0)0.93±0.23子宫内膜情况 增殖期61(61.0)0.91±0.23 分泌期39(39.0)0.96±0.25
3.血清miR-205水平与OEMs传统标志物水平、临床特征的相关性:相关性分析显示,OEMs组血清miR-205水平与血清CA125、VEGF、EMAb水平、r-AFS呈负相关(P<0.05),与年龄、子宫内膜情况、疾病类型无明显相关性(P>0.05)。见表3。
表3 血清miR-205水平与OEMs传统标志物水平、临床特征的相关性
miR-205指标CA125VEGFEMAb年龄r-AFS疾病类型子宫内膜情况r-0.628-0.591-0.416-0.105-0.6530.0971.437P<0.001<0.001<0.001 0.143<0.0010.1860.098
4.成功妊娠与未成功妊娠患者血清miR-205、OEMs传统标志物水平比较:OEMs组IVF-ET后第35天妊娠结局为:成功妊娠38例,未成功妊娠62例,根据OEMs诊断结果(是/否)预测IVF-ET结局为未成功妊娠的敏感度为62%(62/100)。未成功妊娠患者入院时血清miR-205水平低于成功妊娠患者,血清CA125、VEGF、EMAb水平高于成功妊娠患者,差异均有统计学意义。见表4。
表4 成功妊娠与未成功妊娠患者血清miR-205、OEMs传统标志物水平比较
与未成功妊娠比较,*P<0.05
妊娠结局例数miR-205CA125(kU/L)VEGF(ng/L)EMAb(ng/L)未成功妊娠620.79±0.181 025.37±112.54851.40±92.360.46±0.11成功妊娠381.02±0.23∗ 907.58±91.37∗765.79±80.14∗0.38±0.09∗
5.血清miR-205、OEMs传统标志物水平预测IVF-ET妊娠结局的价值:以OEMs组IVF-ET后第35天未成功妊娠患者为阳性样本,成功妊娠患者为阴性样本,绘制入院时血清miR-205、CA125、VEGF、EMAb预测OEMs患者IVF-ET妊娠结局为未成功妊娠的ROC曲线(见图1),由图可知,各指标单独预测未成功妊娠的AUC分别为0.744、0.757、0.745、0.774。见表5。
图1 血清miR-205、OEMs传统标志物水平预测IVF-ET妊娠结局的ROC曲线
表5 血清miR-205、OEMs传统标志物水平预测IVF-ET妊娠结局的价值
指标AUC95% CI截断值敏感度(%)特异度(%)PmiR-2050.7440.65～0.830.9043.697.4<0.001CA1250.7570.66～0.84985.01 kU/L95.244.7<0.001VEGF0.7450.65～0.83811.65 ng/L75.871.1<0.001EMAb0.7740.68～0.850.42 ng/L69.481.6<0.001
6.含与不含miR-205预测方案对IVF-ET妊娠结局的预测价值比较:将血清CA125、VEGF、EMAb联合预测作为不含miR-205预测方案,血清miR-205、CA125、VEGF、EMAb联合预测作为含miR-205预测方案。绘制两种预测方案预测OEMs患者IVF-ET妊娠结局为未成功妊娠ROC曲线(见图2),由图可知,不含miR-205预测方案的AUC为0.822(95% CI:0.73～0.89),预测敏感度为82.26%,特异度为78.95%;含miR-205预测方案的AUC为0.947(95% CI:0.88～0.98),预测敏感度为88.71%,特异度为89.47%;与不含miR-205预测方案比较,含miR-205预测方案的AUC明显增大,NRI、IDI均>0(P<0.05)。见表6。
图2 含与不含miR-205预测方案预测IVF-ET妊娠结局的ROC曲线
表6 含与不含miR-205预测方案对IVF-ET妊娠结局的预测价值比较 [OR(95% CI),P值]
预测指标含miR-205预测方案vs不含miR-205预测方案OR95%CIP值AUC差异(95% CI,P)0.130.02～0.230.021NRI0.030.02～0.040.029IDI0.040.03～0.060.037
讨论
EMs是影响全球5%～10%育龄妇女的常见疾病,以子宫外存在子宫内膜样组织为特征,其发生与遗传、激素和免疫因素密切相关[13-14]。EMs虽然是一种良性疾病,但具有种植、侵袭、复发等恶性生物学特征,血管生成是其发生发展的关键因素之一[15]。
miR-205是新发现miRNA分子,位于染色体1q32.2区域LOC642587基因,研究发现其与多种肿瘤的发生发展密切相关[16-17]。李军等[18]研究结果显示,子宫内膜癌患者血清miR-205水平显著高于健康对照组,可作为子宫内膜癌诊断的标志物。刘建兵等[19]研究发现,miR-205在宫颈鳞癌中表达明显增高,具有促进宫颈鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用。但卵巢癌、前列腺癌组织中miR-205表达明显下调[8,20]。说明miR-205在不同组织中发挥不同生物学作用。本研究结果显示,OEMs患者血清miR-205水平明显低于同年龄段健康女性。说明血清miR-205水平降低与OEMs发生有关。Sheikhvatan等[21]研究显示,EMs患者miR-205表达下调,在EMs向卵巢癌的转化过程中起着重要作用。其作用机制与miR-205可负靶向调控VEGF表达有关[22]。Wang等[23]报道指出,miR-205-5p在EMs患者异位子宫内膜组织中低表达,其表达水平与子宫内膜细胞的增殖、迁移和侵袭能力成反比。Zhou等[24]研究发现,miR-205-5p能通过靶向调节子宫内膜间质细胞中的ANGPT2来抑制人类EMs的进展。
本研究还发现,OEMs患者血清miR-205水平与血清CA125、VEGF、EMAb水平、r-AFS呈负相关。其中,CA125是与EMs密切相关的标志物,EMs所致内异病灶种植部位腹膜受损,CA125大量进入血液循环,加速EMs病情进展[25]。VEGF则是反映机体血管形成的主要因子,其表达水平升高可促进新血管生成,为异位上皮细胞的增殖、迁移提供营养支持,且高水平VEGF能促进上皮下血管网增生,最终促进EMs发生、进展[26-27]。EMAb是与免疫反应密切相关的重要自身抗体,随着EMs病情进展,患者血清EMAb明显升高[28]。r-AFS是评估EMs病情程度的重要工具,r-AFS越高患者病情越严重。由此可见,血清miR-205水平降低可能通过负向调节CA125、VEGF、EMAb表达来促进OEMs的发生发展。
此外,OEMs是导致孕龄期女性不孕的主要因素之一,通过IVF-ET有助于改善妊娠结局。本研究结果显示,根据OEMs诊断结果预测IVF-ET结局为未成功妊娠的敏感度为62%,在预测IVF-ET结局中的价值有限。OEMs患者IVF-ET后第35天未成功妊娠患者入院时血清miR-205水平低于成功妊娠患者,血清CA125、VEGF、EMAb水平高于成功妊娠患者。说明入院时血清miR-205、CA125、VEGF、EMAb水平与OEMs患者IVF-ET妊娠结局有关,在预测妊娠结局方面具有一定潜力。本研究进一步通过ROC曲线分析发现,入院时血清miR-205、CA125、VEGF、EMAb预测OEMs患者IVF-ET妊娠结局为未成功妊娠的AUC均在0.7以上,具有一定预测效能,但各指标单独预测的价值有限。本研究结果显示,与不含miR-205预测方案的AUC比较,含miR-205预测方案的AUC明显增大,为0.947,NRI、IDI均>0。说明含miR-205预测方案在预测IVF-ET妊娠结局方面具有较高预测价值,可为临床预测IVF-ET妊娠结局提供更可靠临床依据。
综上可知,OEMs患者血清miR-205水平显著下调,与血清CA125、VEGF、EMAb水平呈负相关关系,且在预测IVF-ET妊娠结局方面具有一定预测效能,特别是与血清CA125、VEGF、EMAb水平联合能明显提高预测价值。本研究不足之处在于未对比分析血清miR-205与其他类型微小RNA的预测价值,未来工作中会进一步深入探讨。
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