多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是一种与内分泌失调相关的生殖功能障碍,最常见于育龄妇女[1]。PCOS患者会出现多种严重的临床后遗症,包括高雄激素血症、持续性无排卵、多囊卵巢、胰岛素抵抗和肥胖等[2-3]。“阴平阳秘”是中医基础理论的重要内容之一,指的是阴气平和、阳气固密,阴阳两者相互协调,保持相对平衡的状态[4]。这种平衡状态是人体健康的基础,故而精气血津液、脏腑经络、四肢百骸各就其位,各司其职,精(物质)、气(信息)、神(功能)皆备,达到形神统一,正气存内,邪不可干之境界[5]。阴平阳秘的失衡可能表现为阴虚火旺,导致月经不调、肥胖、多毛等症状,这些都是PCOS的典型表现[6]。近年来,昼夜节律变化在PCOS中的作用引起了相当大的关注,昼夜节律紊乱可能影响内分泌系统的正常功能,影响下丘脑-垂体-卵巢轴的协调,导致激素如促黄体生成素(luteinizing hormone, LH)和卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)分泌异常,这是PCOS发生的一个重要标志[7]。昼夜节律紊乱可以通过氧化应激和炎症等机制触发或加速PCOS患者体内阴阳失衡,从而加重PCOS[8]。本研究基于“阴平阳秘”理论探讨昼夜节律紊乱对PCOS模型大鼠性激素及卵巢形态的影响,以及可能的作用机制。
材料与方法
一、实验动物
40只SD雌性大鼠,21日龄,购自成都达硕实验动物有限公司,许可证编号SCXK(川)2020-0030。本动物实验经山西中医药大学医学伦理委员会审查,认为该项目符合医学伦理学要求,同意申报,项目批准号:AWE202209037。
二、实验材料及仪器
脱氢表雄酮(DHEA)(货号:D106380)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。HRP标记山羊抗兔IgG(货号:GB23303)购自武汉赛维尔生物科技有限公司。Rat LH ELISA KIT(货号:ZC-36719)、Rat E2 ELISA KIT(货号:ZC-36464)、Rat T ELISA KIT(货号:ZC-36635)、Rat FSH ELISA KIT(货号:ZC-36477)购自上海茁彩生物科技有限公司。Smad1/5/9(货号:ab300164)购自Abcam。BMP6(货号:A8333)、Smad4(货号:A17116)、β-actin(货号:AC026)单克隆抗体购自Abclonal。WB试剂盒(货号:P0013)、BCA蛋白定量试剂盒(货号:P0009)购自上海碧云天生物技术有限公司。酶标仪(SpectraMAX Plus384)购自美谷分子仪器有限公司。荧光图像分析系统(5200 Multi)购自Tanon。台式高速冷冻离心机(H2050R)购自湘仪集团。超薄切片机(UC7rt)购自LEICA。透射电子显微镜(JEM-1400FLASH)购自日本电子(JEOL)。
三、方法
1.动物造模与分组:SD大鼠,21日龄,适应性饲养1周后,随机分为对照组10只、PCOS模型组30只。对照组大鼠在正常光照(光∶暗=12 h∶12 h)下饲养,并皮下注射大豆油,1次/天,连续3周。PCOS组大鼠采用脱氢表雄酮(DHEA)注射法构建PCOS模型大鼠,具体步骤:正常光照(光∶暗=12 h∶12 h)下饲养,并皮下注射DHEA 60 mg/kg(溶于注射用大豆油),1次/天,连续3周。每天观察大鼠摄食、毛发及精神一般活动情况,出现体型肥胖,体重上升,喜静不喜动,初步判定造模成功。从造模第12天开始,每日9:00取阴道冲洗液脱落细胞涂片,检测发情周期变化,连续10 d。造模结束后ELISA检测性激素水平。
2.动物分组与处理:造模成功的PCOS模型大鼠30只,随机分为PCOS组、PCOS+PL组(长光照组)、PCOS+CL组(持续光照组),各10只,PCOS组大鼠在正常光照(光∶暗=12 h∶12 h)下饲养,PCOS+PL组在长光照(光∶暗=18 h∶6 h)条件下饲养,PCOS+CL组在持续光照(光∶暗=24 h∶0 h)条件下饲养,对照组大鼠在正常光照(光∶暗=12 h∶12 h)下饲养,连续3周。
3.ELISA法检测血清LH、FSH、E2、T水平:采集全血进行离心处理,以3 000 r/min,离心5 min,-70 ℃保存,采用ELISA法检测,加入样品、对照品后37 ℃反应30 min,洗板5次,加入酶标试剂,37 ℃反应30 min,再次洗板,加入显色液,37 ℃显色10 min,加入终止液,在450 nm波长处测定各孔的OD值,计算大鼠血清LH、FSH、E2、T水平。
4. 大鼠体重及卵巢系数计算:记录各组大鼠卵巢质量与体质量,并计算卵巢系数(相对质量),卵巢系数=卵巢质量/体质量。
5. HE染色观察卵巢组织形态及有腔卵泡和囊状卵泡计数:采血结束后,脱颈处死大鼠,分离出卵巢组织。甲醛固定卵巢组织,无水乙醇脱水处理,二甲苯透明、包埋,切片机切片,苏木精染色10 min,自来水冲洗3 min,伊红染色5 min;梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固,光学显微镜观察卵巢组织病理学变化,并进行有腔卵泡和囊状卵泡计数。
6. 透射电镜观察卵巢组织超微结构变化:将大鼠麻醉后断头,于冰上取卵巢组织并修成1 mm3的小块,置于4% 的戊二醛内固定2 h以上。1%四氧化锇酸再固定2 h,PBS冲洗。梯度丙酮脱水,包埋剂包埋,恒温箱内聚合。1 μm半薄切片,甲苯胺蓝染色定位,50～70 nm 超薄切片,柠檬酸铅-醋酸双氧铀双染,透射电子显微镜下观察,拍照。
7. Western blot检测BMP6、Smad4和Smad1/5/9蛋白水平:取大鼠卵巢组织研磨,提取组织中总蛋白,对蛋白定量(BCA 试剂盒),进行 SDS-PAGE 凝胶电泳分离,分离蛋白转到 PVDF 膜,封闭,加入一抗BMP6(1:2 000);Smad4(1:2 000);Smad1/5/9(1:1 000);β-actin(1:50 000),4 ℃孵育过夜;将PVDF膜放入二抗(稀释浓度为1:5 000)中,室温孵育2 h,ECL显色,测定蛋白表达情况。
四、统计学处理
采用SPSS 20.0软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差
表示,多组间采用单因素方差检验,进一步两两比较,采用LSD-t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。
结果
一、 PCOS模型大鼠一般情况及动情周期变化结果
对照组大鼠展现出5～6 d的正常动情周期,涵盖动情前期、动情期、动情后期及动情间期。在动情前期,观察到含有细胞核的圆形上皮细胞;动情期则主要是形态不规则的、无细胞核的角化鳞状上皮细胞;动情后期,上皮细胞数量减少,白细胞增多,角化细胞含量降低;动情间期则表现为白细胞的大量出现。相较之下,PCOS组动情周期不规律,无交替变化的规律发情周期或动情周期延长,表现为持续角化的阴道上皮细胞,结果见图1。
Note:Compared with Control group,*P<0.05,**P<0.01;Compared with PCOS group,#P<0.05
图1 大鼠动情周期统计(Proestrus:动情前期,Estrus:动情期;Metestrus:动情后期; Diestrus:动情间期)
A:显微镜下阴道涂片B:不同组大鼠动情周期统计柱状图
Figure 1 Estrus cycle statistics of female mice in PCOS group and control group A: Microscopic vaginal smear B: Bar chart of estrous cycle statistics of different groups of rats
二、大鼠体重及卵巢相对质量的检测结果
造模完成后,PCOS大鼠体重大于对照组,但无统计学差异。计算卵巢相对重量发现,与对照组相比,PCOS组、PCOS+PL组和PCOS+CL组大鼠卵巢系数显著升高(P<0.05);与PCOS组相比,PCOS+CL组大鼠卵巢系数显著升高(P<0.01),PCOS+HL组与PCOS组相比差异无统计学意义。结果见表1。
表1 各组大鼠体重及卵巢系数的检测结果
Table 1 Results of body weight and ovarian coefficient of rats in each 
n=10)
Note:Compared with Control group,*P<0.05,**P<0.01;Compared with PCOS group,##P<0.01
GroupsWeight(g)Ovarian coefficient(%)Control238.0±3.93.4±0.4PCOS240.1±1.85.2±0.4∗PCOS+PL277.9±57.55.2±0.1∗∗PCOS+CL236.5±7.97.3±0.1∗∗##
三、大鼠卵巢组织病理形态学观察及有腔卵泡和囊状卵泡计数结果
对照组卵巢被膜完整,皮质区原始卵泡、初级卵泡及次级卵泡等数量较为正常,各级卵泡发育正常;髓质区纤维结缔组织排列紧密,未见明显水肿或坏死,未见明显的炎细胞浸润及纤维组织增生。PCOS组卵巢结构发生病理性改变,卵巢内见囊状扩张卵泡并呈现多囊样病理改变,锁闭卵泡多发,潴留囊肿明显,颗粒细胞减少,卵泡膜细胞增多。PCOS组、PCOS+PL组和PCOS+CL组卵巢内见囊状扩张卵泡较多并呈现多囊样病理改变,锁闭卵泡多发,颗粒细胞层明显变薄、数量减少,卵泡膜细胞增多,且PCOS+CL组较为明显。与对照组相比,PCOS组、PCOS+PL组和PCOS+CL组有腔卵泡及囊性卵泡数量增多(P<0.01);与PCOS组相比,PCOS组+PL组有腔卵泡和囊状卵泡数量增加但差异无统计学意义,PCOS+CL组,有腔卵泡数量(P <0.05)、囊状卵泡数量(P <0.01)显著增加。结果见图2。
Note:Compared with Control group,**P<0.01;Compared with PCOS group,#P<0.05,##P<0.01
图2 HE染色观察各组大鼠卵巢组织病理形态学及有腔和囊状卵泡计数(×200)
A:卵巢组织HE染色病理图B:有腔和卵状囊泡数量统计柱状图
Figure 2 HE staining was used to observe the ovarian histopathology and the number of antral follicles and vesicular follicles in each group(×200)
A: HE-stained pathological image of ovarian tissue B: Bar chart of the number of antral follicles and vesicular follicles
四、大鼠卵巢组织中卵泡细胞超微结构改变情况
对照组颗粒细胞的细胞核和胞浆中细胞器均正常;PCOS组颗粒细胞的细胞核正常,胞浆中细胞器轻微异常;PCOS+PL组颗粒细胞的细胞核无明显异常,胞浆中细胞器出现较明显异常;PCOS+CL组颗粒细胞的细胞核固缩,胞浆中细胞器明显异常。结果见图3。
图3 各组大鼠卵巢组织细胞超微结构(×20 000,Bar=500 nm)
Figure 3 Ultrastructure of ovarian cells in each group(× 20 000, Bar=500 nm)
五、大鼠血清中LH、FSH、E2、T水平的检测结果
与对照组相比,PCOS组、PCOS+PL组和PCOS+CL组大鼠血清中LH、E2、T水平均显著升高(P<0.01),FSH水平显著降低(P<0.01);与PCOS组比较,PCOS+PL组大鼠血清中E2、T水平均显著升高(P<0.05),FSH水平显著降低(P<0.05),LH水平差异无统计学意义(P>0.05),PCOS+CL组大鼠血清中LH、E2、T水平均显著升高(P<0.01),FSH水平显著降低(P<0.01),结果见表2。
表2 各组大鼠LH、FSH、E2、T浓度的变化
Table 2 Changes of LH, FSH, E2, T concentrations in each n=10)
Note:Compared with Control group,**P<0.01; Compared with PCOS group,#P<0.05,##P<0.01
GroupsLH(mIU/mL)FSH(IU/L)E2(pmol/L)T(pg/mL)Control3.8±0.71.5±0.14.2±0.423.7±6.3PCOS7.1±0.8∗∗0.8±0.7∗∗6.5±0.5∗∗49.5±5.7∗∗PCOS+HL8.0±0.9∗∗0.7±0.4∗∗#7.5±0.6∗∗#60.4±4.3∗∗#PCOS+CL9.1±0.6∗∗##0.6±0.9∗∗##8.1±0.6∗∗##66.5±3.9∗∗##
六、大鼠卵巢组织中BMP6、Smad4和Smad1/5/9蛋白水平表达检测结果
通过Western blot检测各组大鼠卵巢组织BMP6、Smad4和Smad1/5/9蛋白表达水平结果如下,与对照组相比,PCOS组、PCOS+PL组和PCOS+CL组中BMP6、Smad4和Smad1/5/9蛋白表达水平均显著降低(P<0.01);与PCOS组相比,PCOS+PL组和PCOS+CL组中BMP6、Smad4和Smad1/5/9蛋白表达水平均显著降低(P<0.01)。结果见图4、表3。
表3 各组大鼠BMP6、Smad4和Smad1/5/9蛋白表达水平比较
Table 3 Comparison of BMP6, Smad4 and Smad1/5/9 protein expression in each n=10)
Note:Compared with Control group,**P<0.01; Compared with PCOS group,##P<0.01
GroupsBMP6Smad4Smad1/5/9Control1.0±0.01.0±0.01.0±0.1PCOS0.4±0.1∗∗0.4±0.0∗∗0.4±0.0∗∗PCOS+PL0.3±0.1∗∗##0.3±0.0∗∗##0.3±0.1∗∗##PCOS+CL0.1±0.0∗∗##0.2±0.0∗∗##0.2±0.0∗∗##
图4 各组大鼠BMP6、Smad4和Smad1/5/9蛋白表达情况
Figure 4 BMP6, Smad4 and Smad1/5/9 protein expression in each group
讨论
多卵巢综合征(PCOS)是一种复杂的内分泌疾病,其特征包括排卵不足或无排卵、雄激素水平高、多囊卵巢等[9]。育龄女性PCOS的患病率为10%～15%,已成为影响生殖和代谢最常见的综合征[10]。近年来,环境因素特别是昼夜节律紊乱在PCOS调查中引起了广泛关注[11]。昼夜节律通过位于下丘脑视交叉上核(SCN)的主要昼夜节律起搏器调控,SCN会根据环境的光/暗周期来调整内部时间顺序,以确保生理和行为节奏与昼夜节律、睡眠和清醒、体温、进食等在24 h周期内协调进行[12-13]。迄今为止,一些研究已经揭示了昼夜节律与PCOS之间的密切关系。患有PCOS的青春期女孩经历了昼夜节律紊乱,另一项研究表明,PCOS患者似乎更容易受到昼夜节律紊乱的影响,可能是由于异常的褪黑激素水平参与神经内分泌病理过程[14-15]。“阴平阳秘”学术理论最早出自《黄帝内经》,不仅是中医预防医学的精粹,也是治疗疾病的指导思想[16]。昼为阳,夜为阴,不同的时间段,阴阳的盛衰也随之变化,人体阴阳失衡时,也可能会影响身体内部的调节机制,进而影响正常的昼夜节律[17]。而长期的昼夜节律紊乱可能会损耗人体的阴气和阳气,使得阴阳之间的相互制约和相互依存关系失衡。本实验成功制备PCOS模型大鼠,研究结果显示昼夜节律紊乱会增加大鼠体重、卵巢系数降低,卵巢组织形态较PCOS组加重,有腔卵泡和囊状卵泡数量增加,表明昼夜节律紊乱加速PCOS发生发展。
LH、FSH、E2 以及相应的激素受体共同对卵巢发挥作用,对雌孕激素的分泌予以调控,从而对雌性机体的动情周期、卵泡发育以及排卵进程产生影响[18]。PCOS 患者存在 LH、FSH 分泌的不均衡状况,表现为 LH 水平上升,FSH 水平降低;LH 水平的增高会进一步促使卵泡膜细胞大量合成 T,于卵巢中营造出高雄激素的环境,进而对优势卵泡的发育造成阻碍[19-20]。PCOS患者卵巢和血液中E2水平通常会升高,反映了颗粒细胞功能障碍和雌激素生成增加[21]。研究表明,持续光照会刺激LH的分泌,引起啮齿类动物卵巢形态的变化和高雄激素血症,表明昼夜节律的变化可能引发PCOS[22-23]。此外还有研究发现,人类和动物持续暴露在光照下也会导致FSH和E2水平升高[24]。本研究结果发现,昼夜节律紊乱可升高LH、E2和T水平,可降低FSH水平,且光照时间越长激素分泌越紊乱。
骨形态发生蛋白(BMP)属于转化生长因子β(TGF-β)超家族,对于维持女性生殖健康非常重要[25]。先前的研究发现,BMP2、BMP4、BMP6和BMP7等多种BMP蛋白能够调节人类颗粒细胞中透明质酸的合成,进而影响排卵[26-27]。这些蛋白通过与TGF-β的I型和II型受体结合,在细胞膜上发生磷酸化,激活胞内信号传导介质SMAD1/5/9[28]。尤其是BMP6,已被证实通过调节卵巢间细胞通讯,对哺乳动物的卵泡功能、卵母细胞成熟和黄体功能发挥调控作用[29]。临床研究表明,卵巢中BMP6信号传导的异常与多囊卵巢综合征及排卵障碍的发病机制密切相关[30]。综上所述,BMP6是维持正常卵泡发育的关键内源性调节因子。Smad4是经典 BMP/Smad信号通路的最终信号分子且可以通过正反馈调节经典 BMP/Smad信号通路[31]。研究表明,Smad4是BMP6诱导的下游信号通路中不可或缺的介质[32]。由此推测昼夜节律紊乱可能通过调节BMP/Smad信号通路来诱发或加速PCOS发展。本研究结果发现,PCOS模型大鼠卵巢组织中BMP6、Smad4和Smad1/5/9表达水平显著降低,即BMP/Smad信号轴被抑制。持续光照后,大鼠卵巢组织中BMP6、Smad4和Smad1/5/9表达水平显著降低,可见昼夜节律紊乱可通过下调BMP/Smad信号通路来加重PCOS。
综上所述,昼夜节律紊乱破坏体内阴阳平衡,加重PCOS大鼠性激素分泌失常,影响卵巢正常功能和形态,其作用机制可能与下调BMP/Smad信号通路有关。本研究为理解昼夜节律紊乱与PCOS之间的关系提供了新的视角,也为探索基于“阴平阳秘”理论的干预策略提供了科学依据,为PCOS的治疗提供新的思路和方法。
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