圆头精子症是一种罕见的、可导致男性不育的特殊类型畸形精子症,最早由Sen等[1]于1971年报道。圆头精子症的主要特征是精子头部呈圆形并伴有顶体缺失,细胞核周围的细胞骨架有缺陷、顶体后鞘缺失、核膜分离及尾部卷曲[2-3]。圆头精子症根据圆头(无顶体)精子所占的比例分为两型:Ⅰ型又称完全型,即射出的精子中完全缺乏顶体;Ⅱ型又称部分型,部分射出精子中存在顶体小泡[4-5]。目前关于圆头精子症的研究主要集中在圆头精子症精子的结构特点、遗传学及受孕能力方面;对于完全型圆头精子症、部分型圆头精子症患者间的精液参数比较的研究有限,且存在一定的争议[6]。本文将对完全型圆头精子症、部分型圆头精子症和非圆头型精子症三种人群的精液常规参数、精子形态和精子DNA碎片指数(DNA fragment index,DFI)进行比较,探讨其与男性不育的关系。
材料与方法
1.临床材料:根据精子形态学分析结果,选取2020年5月至2022年3月来本院做精液检查的患者中完全型圆头精子症(100%无顶体的精子)患者21例和部分型圆头精子症(>80%且<100%的无顶体或有很少顶体的精子)患者55例作为病例组。对照组为同时期内随机选取的来我院做精液检查的非圆头精子症患者250例。
2.病例分组依据:本研究对于完全型圆头精子症和部分型圆头精子症的诊断鉴别主要依据患者精子形态学分析,将光学显微镜下观察形态特征为精子头部全部呈小圆头,且伴随顶体缺失的精液标本归类为完全型圆头精子症病例。标本中除了圆头精子外(比例>80%),还存在正常形态的精子,这类病例归为部分型圆头精子症[6]。除上述两种形态外的其他病例称之为非圆头精子症即本研究中的对照组(图1)。
A.完全型圆头精子,b.部分型圆头精子,c.非圆头精子
图1 巴氏染色后的精子形态(×100)
3.精液样本采集:患者精液采集前禁欲2～7 d,采用手淫法留取精液标本于无菌无毒的广口取精杯内,称重法记录精液体积后置于37℃恒温箱内液化待分析。
4.精液常规分析:精液液化后混匀,取4 μL精液滴于一次性精液计数板(Geoffrey,江苏南京)中,采用CASA精液分析仪(穗加SSA-Ⅱ Plus精子分析系统,北京)对精子进行分析,检测精子浓度、精子前向运动百分率(progressive motility,PR)、精子活动率等精液常规指标。
5.精子形态分析:精液液化后混匀,取5～10 μL精液采用拉薄技术制备精液涂片,自然干燥后采用改良巴氏染色法染色。根据《WHO人类精液检查与处理实验室手册》(第5版)[7]的标准,观察至少200条精子并记录不同畸形精子个数及正常精子个数,计算形态正常精子率。
6.精子DNA完整性检测:按照精子DNA碎片染色试剂盒(流式细胞法,安徽安科)说明书操作,用精子稀释液将液化后的精液稀释至精子浓度1×106/mL ～5×106/mL,在流式细胞仪上样管中依次加入100 μL稀释后的精液,200 μL裂解液冰上孵育30秒,再在避光环境中加入600 μL吖啶橙染液(acridine orange,AO),充分混匀后通过流式细胞仪(ACEA NovoCyte D1040,美国Agilent公司)设门,然后对染色好的样品进行检测。采集10 000个精子,计算其中红色荧光精子的百分比,即为精子DNA碎片指数(DNA fragment index,DFI)。
7.统计学分析:运用统计软件SPSS 26.0进行数据的统计分析。病例组和对照组数据符合正态分布,使用
表示,偏态分布的数据使用M(P25,P75)表示。年龄和体积的组间比较采用单因素方差分析(ANOVA);精子总数,精子浓度,PR%和DFI组间比较采用Kruskal-Wallis检验,形态正常精子率组间比较采用Mann-Whitney U检验;圆头精子症、部分圆头精子症和非圆头精子症与精子总数、精子浓度、PR、形态正常精子率、DFI之间相关性研究采用Spearman相关性分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。
结果
1.两组病例组与对照组基本信息和精液参数分析的比较:完全型圆头精子症组者和部分型圆头精子症组患者的平均年龄分别为(31.2±4.4)岁和(30.4±4.4)岁,对照组为(31.1±3.7)岁。三组年龄均数无统计学差异(P>0.05)。在精液参数分析方面,三组间的精液体积均数无统计学差异(P>0.05);完全型圆头精子症组和部分型圆头精子症组与对照组相比,精子总数、精子浓度和PR值均显著低于对照组(P<0.05),虽然完全型圆头精子症组的精子总数、精子浓度和PR值也小于部分型圆头精子症组,但差异无统计学意义(P>0.05);病例组形态正常精子率显著低于对照组(P<0.05);部分型圆头精子症组的DFI值最高,其次是完全型圆头精子症组,对照组最低,病例组与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05),完全型圆头精子症组与部分型圆头精子症组的DFI值差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。
表1 三组患者基本信息和精液参数比较
注:与对照组比较,*P<0.05
变量完全型圆头精子症组部分型圆头精子症组对照组年龄(岁, x±s)31.2±4.430.4±4.431.1±3.7精液体积(mL, x±s)3.8±1.54.0±1.44.0±1.6精子浓度[×106/mL,M(P25,P75)]27.0(12.2,44.5)∗31.2(11.9,53.3)∗52.4(30.1,81.7)精子总数 [×106,M(P25,P75)]86.4(42.0,158.1)∗112.9(57.2,198.3)∗182.4(117.1,287.1)PR [%,M(P25,P75)]39.3(12.2,52.0)∗45.0(27.2,56.7)∗62.8(51.4,72.4)形态正常精子率[%,M(P25,P75)]-0.9(0.5,1.0)∗3.3(2.0,4.9)DFI [%,M(P25,P75)]17.9(10.4,26.5)∗19.5(11.9,29.1)∗11.7(7.1,18.6)
2.病例组与对照组间精液参数相关性分析:为显示完全型圆头精子症、部分型圆头精子症、非圆头精子症与各项指标相关性,本研究将完全型圆头精子症、部分型圆头精子症和非圆头精子症设为等级变量(完全型圆头精子症=1,部分型圆头精子症=2,非圆头精子症=3),利用Spearman秩相关分析进行了相关性分析,结果见表2。随着圆头精子症程度的递减(圆头精子数量的减少),形态正常精子率、精子浓度、精子总数和PR呈递增趋势,DFI呈递减趋势。
表2 完全型圆头精子症、部分圆头精子症、非圆头精子症与各项指标相关性分析
统计量形态正常精子率精子浓度精子总数PRDFI相关系数(r)0.640.290.290.43-0.27P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001
3.DFI与精液参数相关性分析:为了研究病例组圆头精子症与对照组非圆头精子症间DFI和精液参数的关系,本研究利用相关性分析,统计了圆头精子症与非圆头精子症所有患者的DFI与精液参数中各项指标的相关性,结果见表3,DFI与形态正常精子率、精子浓度和PR呈负相关(P<0.05),与精子总数之间相关性无统计学意义(P>0.05)。
表3 圆头精子症与非圆头精子症患者DFI与精液参数各项指标相关性分析
统计量形态正常精子率精子浓度精子总数PR相关系数(r)-0.29-0.18-0.10-0.58P<0.0010.0010.060<0.001
为了进一步研究圆头精子症中完全型圆头精子症和部分型圆头精子症患者的DFI和精液参数的关系,本研究分析了DFI与形态正常精子率、精子浓度、精子总数和PR的相关性结果见表4。由表4可见,完全型圆头精子症与部分型圆头精子症患者中,DFI仅与PR呈负相关(P<0.001),与形态正常精子率、精子浓度和精子总数之间相关性无统计学意义(P>0.05)。
表4 完全型圆头精子症与部分型圆头精子症患者DFI与精液参数各项指标相关性分析
统计量形态正常精子率 精子浓度精子总数PR相关系数(r)-0.09-0.030.05-0.44P0.4310.7960.645<0.001
讨论
圆头精子症是一种比较罕见不育症,由于其极低的受精率近些年被广泛关注。圆头精子症可以分为完全型和部分型两种类型[4-5],其主要特点是精子头圆,缺乏顶体;部分型圆头精子症与完全型圆头精子症的主要差异是,部分型圆头精子症患者精液中存在不同比例的小顶体精子和正常形态的精子。虽然最初很多报道将完全型圆头精子症和部分型圆头精子症通称为圆头精子症,但越来越多的证据显示,完全型圆头精子症和部分型圆头精子症在自然受孕几率、胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)和辅助卵母细胞激活(assisted oocyte activation,AOA)后受精率有显著差异,这些差异表明完全型圆头精子症和部分型圆头精子症的区别不仅在于圆头精子所占比例的不同,可能在精子顶体发生、卵母细胞激活及受精机制上也存在差异[8-9],表明部分型圆头精子症可能是一种独立于完全型圆头精子症而存在的独特的精子畸形。
本研究将圆头精子症分为完全型圆头精子症和部分型圆头精子症,同时与非圆头精子症患者的精液参数进行比较,研究圆头精子症与男性不育的关系。结果显示病例组和对照组的精液量之间没有差异,但是圆头精子症患者的精液在精子总数、精子浓度、PR、形态正常精子率方面显著低于对照组,同时完全型圆头精子症的精子总数、精子浓度和PR要低于部分型圆头精子症,但差异不显著。通过以上数据可以看出,圆头精子症患者的精液参数显著低于非圆头精子症的不育患者。这是造成圆头精子症患者不育的一个重要因素,但人们普遍认为,精子参数异常本身并不能反映圆头精子症患者的生育潜力。已知造成圆头精子症患者不育的最重要因素是他们的精子无法结合透明带并穿透卵母细胞,即精子不能自然受精,因此,ICSI是实现怀孕的唯一解决方案。然而,常规ICSI后的圆头精子症患者的受精率仍然低于正常,这表明这些患者的精子除了无法穿透透明带外,还可能缺乏其他受精所必需的机制[10]。一个需要考虑的重要因素是染色质结构和DNA完整性的异常。在之前的研究中,有研究者利用基因敲除小鼠、SNP-array筛选等方法寻找到13个可能与圆头精子症相关的基因,它们大多数参与高尔基体网络形成、精子顶体形成、顶体与精子细胞核的锚定和透明带结合,但是只有其中的DPY19L2、SPATA16、PICK1和Calicin四个基因在圆头精子症患者中被检出[11-15]。从本研究结果可以看出,圆头精子症患者的精液参数显著低于非圆头精子症不育患者,但已发现的这些造成圆头精子症的基因功能并不能影响生精功能,说明造成圆头精子症,特别是部分型圆头精子症的原因并不只是单个基因缺陷造成的,有待进一步研究。
其中,一个需要考虑的重要因素是染色质结构和DNA完整性的异常对后代的可能影响。据报道,在圆头精子症患者中,精蛋白在精子发生过程中被组蛋白替代干扰,精子DNA碎裂的频率更高,精子染色质异常和染色质不稳定[16-18]。双链断裂可以推迟DNA复制和父系原核的形成,根据其严重程度,它可能导致早期胚胎发育停滞[19-20]。这种差异可能解释了在ICSI后应用AOA的情况下受精率低和胚胎发育不良的情况。因此,除了无法诱导卵母细胞激活外,精子染色质质量差可能是ICSI后受精率低、胚胎发育不良和未能怀孕的原因[14]。因此,本研究评估了圆头精子症不育男性的DNA损伤。这一结果清楚地表明,与非圆头精子症患者相比,圆头精子症男性的DFI明显更高。有意思的是本研究结果还显示DFI与精子的PR显著负相关,而与精子浓度、精子总数和形态正常精子率的相关性没有统计学意义。Fesahat[10]在综述中提出了圆头精子症患者精子DNA碎片化(sperm DNA fragmentation,SDF)形成的两种假说:(1)圆头精子症患者由于其染色质凝集异常,这些异常凝集的染色质容易被活性氧(reactive oxygen species,ROS)攻击,造成拓扑异构酶Ⅱ功能异常,导致在生精过程中产生大量SDF;(2)在生精过程中,通过细胞凋亡和细胞死亡途径会大量清除DNA受损的精子,但是这个清除过程会出错,导致部分DNA受损细胞逃脱凋亡,保存下来。同时由于本研究结果显示DFI与PR显著负相关,提示在ICSI挑选精子的过程中尽量挑选前向运动的精子。
综上所述,圆头精子症是一种由于基因突变和染色质异常等原因造成的一种精子畸形导致不育的疾病,虽然现在可以利用ICSI-AOA辅助治疗,但其成功率依然很低,因此对其致病机理和治疗策略仍需要进一步研究。
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