宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，发病率居女性恶性肿瘤的第2位。人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染已被流行病学和生物学证明是引起宫颈癌及癌前病变的必要因素［1］。新疆南部维吾尔族是宫颈癌的高发人群。根据与宫颈癌的关系，HPV可分为高危型和低危型。只有高危型HPV持续性感染才与子宫颈癌及CIN的发生密切相关［2］。2004年，姜淑清等［3］在新疆和田宫颈癌高发地区策乐县进行宫颈癌普查，结果显示，当地维吾尔族妇女宫颈癌的患病率为北京市妇女患病率的210多倍。子宫颈感染患者的HPV负荷量与宫颈病变的严重程度有关［1］。本研究通过对906例维吾尔族妇女进行宫颈液基细胞学和HPV-DNA检测，并同时在阴道镜下行宫颈多点活检结果，以探讨HPV感染与宫颈癌前病变及宫颈癌筛查和病程发展的相关性。
对象与方法
一、对象
2009年8月—2010年5月在本院就诊的维吾尔族妇女患者906例，年龄21～71岁，平均（38.3±0.8）岁；均有性生活史，自愿接受检查，同意行宫颈活检。排除有子宫切除、宫颈手术史和骨盆放射治疗史、妊娠状态者。按HPV-DNA负荷量不同分成＜1、1～、101～、501～、1 001～4 263组。
二、方法
1.检查方法：对接受筛查的患者均进行宫颈细胞学检查、HPV-DNA检测、电子阴道镜检查；阴道镜检查时对可疑病变图像镜下取活检，若镜下未发现可疑病变部位，常规在转移带中3、6、9、12点活检或行宫颈管搔刮术；以组织病理学诊断结果作为最终判断宫颈病变性质的依据。
2.HPV-DNA病毒检查方法和负荷量计算方法：（1）检查方法。使用DINGEN提供的专用样本采集毛刷宫颈处采样。同一方向，旋转3周，停留10 s。将采样小刷子放入样本保存管（内含1 ml样本处理液，能使DNA完整，抑制细菌生长），盖紧并做好标签，送实验室。（2）检测方法。采用美国Digene公司提供的第二代杂交捕获实验（Hybrid Capture2，HC2）技术对13种常见高危型HPV进行检测，HC2检测的敏感度为5 000拷贝／ml。按程序要求进行检测。（3）HPV-DNA负荷量计算。HPV-DNA负荷量（RLU／PC）＝样本的相对光单位（RLU）／标准阳性对照（PC）。按照㏒10RLU／PC将所获得的 HPV-DNA病毒负荷量进行对数变换。（4）结果判定。RLU＝相对光单位，光信号；HPV定量 ＝RLU／Cutoff；1 pg／ml相当于100 000 HPV copies／ml或5 000 HPV copies／assay。（5）判定标准。RLU／Cutoff≥1阳性；RLU／Cutoff＜1阴性，表示未检出13种高危型HPV DNA序列或标本中不含有高危型HPV DNA序列。或按HPV-DNA负荷量分成5组，＜1、1～、101～、501～、1 001～4 263组。浓度水平在测定方法的检测限度以下，如果一个标本的 RLU／Cutoff比接近但小于1.0且被怀疑有高危型HPV感染，应该重新采集标本。
3.病理诊断方法及标准：（1）方法。所有标本均经甲醛固定，经过取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、粘片、脱腊、水洗、HE染色、再脱水、透明、树胶封片、阅片、报告。（2）标准。宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）的病理特征子宫颈非典型增生及原位癌的病理特征为细胞核大、深染、大小形态不一；染色质分布不均匀等核异质改变，按细胞改变程度及异型细胞范围可分为，轻度非典型增生（CINI）表现为细胞异型性轻，排列不整齐，但仍保持极性，异常增殖细胞限于上皮层下1／3；中度非典型增生（CINII）表现为细胞异型性明显，排列较紊乱，异常增殖细胞占据上皮层下2／3；重度非典型增生及原位癌（CINIII）表现为重度非典型增生的上皮细胞异型性显著，失去极性，异常增殖细胞扩展至上皮的2／3或几乎全层。宫颈癌指癌灶辉润间质的范围己超出原位癌的范围，呈网状或团块状融合浸润间质。宫颈炎指宫颈炎症，可有宫颈息肉、宫颈肥大、宫颈腺囊肿病理形态。病理诊断为CIN I、CIN II、CIN III和宫颈癌为阳性。
4.统计学处理：采用SPSS 15.0统计软件进行分析，计量资料以
±s表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t检验；采用Spearman秩相关计算r值分析高危HPV-DNA病毒负荷量与宫颈病变的关系。P＜0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、HPV感染与否宫颈病变比较
906例自愿接受筛查的患者炎症、CIN I、CIN II、CIN III、宫颈癌中 HPV阳性率分别为 20.7%、56.9%、79%、93.5%和 98.9%，各级宫颈病变中HPV的阳性率逐渐升高，不同级别的宫颈病变中HPV感染率差异有统计学意义，见表1。
表1 不同宫颈病变程度中HPV感染情况分析［例（%）］
注：两组比较，*P＜0.001
HPV阳性 320 144（20.7） 37（56.9） 19（79.2） 29（93.5） 91（98.9）
HPV阴性 586 550（79.3） 28（43.1） 5（20.8） 2（6.5） 1（1.1）二、不同HPV-DNA负荷量宫颈病变比较
随着HPV-DNA负荷量增高正常和炎症检出率下降，CIN和宫颈癌的阳性查检出率升高，差异有统计学意义；HPV-DNA负荷量≥1和＜1时的阳性诊断率为55.0%（176／320）和6.1%（36／586），HPVDNA定量≥1时的诊断阳性率较＜1时显著升高，差异有统计学意义；HPV-DNA病毒负荷量101～阳性率检出率高于1～100，差异有统计学意义，HPVDNA病毒负荷量101～，阳性率检出率各组比较，差异无统计学意义；见表2。
表2 不同HPV-DNA定量分组与宫颈病变的关系［例（%）］
＜1 586 550（93.9） 28（4.8） 7（1.1） 1（0.2） 36（6.1）
1～ 154 89（57.8） 33（21.4） 12（7.8） 20（13.0） 65（42.2）101～ 68 25（36.8） 4（5.9） 17（25.0） 22（32.3） 43（63.2）501～ 25 7（28.0） 0 9（36.0） 9（36.0） 18（72.0）1 001～4 263 73 23（31.5） 0 10（13.7） 40（54.8） 50（68.5）三、Spearman相关分析结果
HPV-DNA病毒负荷量与宫颈病变程度呈正相关（r＝0.599，P＜0.01），即 HPV-DNA病毒负荷量随着宫颈病变程度的增高而增加。
讨 论
目前，HPV感染量与宫颈病变的发生与进展是否具有相关性是许多研究的焦点。多数文献报道，HCⅡ检测的HPV-DNA负荷量与宫颈病变的严重程度无关［4］。单纯通过HR-HPV感染阳性或阴性来判断和识别宫颈浸润癌的高风险人群存在很大局限性，因为大部分妇女的HPV感染都会在短期内自动消失，仅有少数持续感染者才有患宫颈浸润癌的可能［5］。如果能在6～12个月内重复检测HPV的感染状况，可以提高预测子宫颈病变的鉴别力［6］。但鉴于目前HPV检测的成本及患者接受重复检测的顺从性，其实际操作的可能性很小。因此，病毒负荷量能否成为诊断或预测宫颈浸润癌的生物标志物是目前有待确定的问题。
有研究结果显示，HR-HPV病毒负荷量与子宫颈病变的程度之间存在着明显的剂量反应关系，病毒负荷量越高，子宫颈病变加重的危险越大［7，8］；有学者采用HC2方法筛查HPV感染者，其宫颈上皮的高危型HPV-DNA负荷量与宫颈病变的程度呈正相关［6］，但并不是所有评价病毒负荷量与子宫颈病变危险性的研究都支持这一论点。高病毒负荷量增加了HPV病毒整合事件的发生，因此，随着病毒负荷量的增高，进展为浸润癌的风险也随之增加。这可能也是高级别病变者病毒负荷量也较高的原因之一。一项前瞻性研究结果显示，反复HPV感染的女性发展到CINⅡ、Ⅲ的危险性增高，持续HPV阴性或一过性HPV感染的女性在随访过程中均未发展为CINⅡ、Ⅲ，作者认为持续性HPV感染在宫颈病变的发展过程中有重要的作用，HPV高负荷量可以作为宫颈病变进展的短期指标［7］。有资料显示，和田地区维吾尔族宫颈癌的患病率高达560／10万，高危型 HPV的感染率为7.2%［9，10］。本研究906例研究对象中宫颈癌检出例数为86例，检出率为9.5%，高危型HPV感染率显著低于文献报道中国农村妇女的平均水平［11］，这提示高危型HPV的感染在维吾尔族妇女中可能更容易引发宫颈病变。这源于本院就诊的维吾尔族妇女多是源于新疆南部地区的维吾尔族妇女，该地区为宫颈癌的高发地区，而且该区域经济落后，绝大多数女性未能定期进行常规体检。本研究结果显示，宫颈癌和子宫颈癌前病变的HPVDNA负荷量总体分布与正常人群或子宫颈炎组不同；宫颈病变程度越高，HPV-DNA病毒负荷量越高，两者呈正相关；在正常宫颈或宫颈炎的女性中，大多数（79.3%）无高危型 HPV感染，宫颈炎中 HPVDNA病毒负荷量高的妇女仅占3.6%；宫颈癌和子宫颈癌前病变在HPV-DNA负荷量＞100后的分布相对集中平稳；此外，随着宫颈癌前病变级别的增加，HPV-DNA负荷量呈递增趋势，说明子宫颈HPVDNA负荷量可能与子宫颈癌的发生和发展有关，高水平的HPV-DNA负荷量可能促进子宫颈从慢性子宫颈炎状态逐步进展到子宫颈癌前病变的CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ，进而发生宫颈癌变。
有学者认为，HC II检测HPV-DNA阳性阈值按厂商提供的检测样本的RLU／标准阳性对照的RLU／110，阳性阈值太低，检测宫颈病变的敏感性很高而特异性相对偏低，干扰了不同级别宫颈癌前病变的HPV DNA负荷量的差异［12，13］。本研究结果则显示，按HPV-DNA定量≥1作为阳性诊断标准是可取的，尤其对于新疆南部地区维吾尔族妇女，由于随访条件差，降低HPV-DNA阳性标准可以减少漏诊率。另外，不同级别的宫颈癌前病变其病变的的范围可能有较大差异，而脱落细胞的取样量不同等均可影响不同级别癌前病变的HPV-DNA负荷量，而HPV检测有很好的阴性预测值［14］。对于 HCⅡ检测HPV-DNA负荷量其他方面的临床意义，如不同病理类型的宫颈癌与HPV-DNA负荷量的关系，高水平HPV-DNA负荷量是否预示着宫颈HPV持续性感染，是否可以作为监测HPV感染干预措施的疗效指标等，还有待于进一步研究。
参考文献
1 Cogliano V，Baan R，Straif K，et al.Carcinogenicity of human papillomaviruses.Lancet Oncol，2005，6：204.
2 Bodily J，Laimins LA.Persistenceofhuman papillomavirus infection：keys tomalignant progression.Trends Microbiol，2011，19：33-39.
3 蒋淑清，土宋爱，周爱兰，等.新疆策勒县妇女病现状调查与分析.中国妇幼保健，2006，21：524-526.
4 张秀清.妇女人乳头瘤病毒测定与宫颈癌及癌前病变关系的探讨.当代医学，2010，16：38.
5 马晓，李亚里，胡凌云，等.HR-HPV负荷量与宫颈病变的相关性分析.解放军医学杂志，2012，37：477-481.
6 Schlecht NF，Trevisan A，Duarte-Franco E，et al.Viral load asa predictor of the risk of cervical intraepithelial neoplasia.Int JCancer，2003，103：519-524.
7 李丽，玛依努尔·尼亚孜，苏莱亚·胡赛因，等.新疆维吾尔族妇女宫颈癌筛查方法横断面比较研究.中国肿瘤，2010，19：238-242.
8 李丽，玛依努尔·尼亚孜，陈凤，等.新疆维吾尔族女性HPV感染状况及其分布特征研究.癌症进展，2010，8：114-119.
9 李霓，代敏.中国妇女人乳头瘤状病毒感染的多中心横断面研究.中华疾病控制杂志，2008，12：411-415.
10 Carvalho MO，Almeida RW，Leite FM，etal.Detection of human papillomavirus DNA by the hybrid capture assay.Braz JInfectDis，2003，7：121-125.
11 段芬，王英红，张文杰，等.新疆维汉妇女HR-HPV负荷量与不同宫颈病变的相关性研究.中国妇幼保健，2006，27：3070-3073.
12 Howard M，Sellors J，Kaczorowski J.Optimizing the hybrid capture II human papillomavirus test to detect cervical intraepithelial neoplasia.Obstet Gynecol，2002，100：972-980.
13 Schlecht NF，Kulaga S，Robitaille J，et al.Persistent human papillomavirus infection as a predictor of cervical intraepithelial neoplasia.JAMA，2010，286：3106-3114.
14 Srodon M，Parry Dilworth H，Ronnett BM.Atypical squamou cells，cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion：diagnostic performance，human papillomavirus testing，and follow-up results.Cancer，2006，108：32-38.