自20世纪80年代以来，米非司酮（RU486）联合米索前列醇用于终止早期妊娠有超过25年的历史，妊娠完全流产率可达90%～95%。米非司酮是受体水平的孕激素拮抗剂，通过阻断孕酮受体（progesterone receptor，PR），引起绒毛及蜕膜组织退变、坏死而终止妊娠。孕激素是维持成功妊娠最重要的类固醇激素。孕酮作用于妊娠淋巴细胞表达的孕酮受体可产生调节蛋白——孕酮诱导阻断因子（progesterone-induced blocking factor，PIBF），有助于正常妊娠的维持，对妊娠起保护作用。米非司酮用于终止早期妊娠，其阻断孕酮受体后是否会引起PIBF的改变，有待进一步研究。本研究通过对孕早期药物流产患者母胎界面中PIBF及PR的研究，探讨米非司酮对绒毛及蜕膜影响的作用机制。
对象与方法
一、对象
2012年7月—2013年1月在苏州大学附属第二医院计划生育门诊进行诊断并自愿要求终止早期妊娠，药物流产成功（药流成功组）、药物流产不全或失败后清宫（药流失败组）及负压吸宫流产（手术组）各30例。入选标准：（1）在本院妇产科门诊确诊为正常早期妊娠，孕周≤7周，超声示正常宫内妊娠，探及妊娠囊，胚芽与孕周相符，探及胎心；（2）既往月经规律，此次妊娠以来无明显感染及服药史，无甾体类激素服用史；（3）经检查排除生殖器官畸形；（4）无甲状腺疾病、糖尿病等；（5）无各种自身免疫性疾病，自身抗体（抗心磷脂抗体、抗核抗体以及抗可溶性抗原）均为阴性。所有标本的使用严格遵照苏州大学附属第二医院伦理委员会要求执行。3组一般资料比较，差异均无统计学意义，见表1。
表1 一般资料比较（
±s）
药流成功组30 27.8±4.4 6.5±0.4 2.4±1.0 0.8±0.6药流失败组 30 26.6±4.0 6.5±0.5 2.4±0.9 0.6±0.5手术组30 27.7±5.0 6.6±0.3 2.4±1.0 0.8±0.5二、方法
1.药物流产方法：予米非司酮片与前列腺素药物序贯合并使用。米非司酮片（25 mg）早2粒、晚2粒，口服2 d，第3天清晨空腹口服米索前列醇600μg。于门诊观察室观察6 h，若孕囊未见排出，阴道出血不多，则回家观察1周。药物流产患者服药前签署知情同意书，已告知相关注意事项，对于回家观察的患者，嘱其注意阴道出血量，若出血量多随诊，门诊亦有专人专线负责电话随访。用药后1周内若孕囊完整排出，阴道出血渐止，复查B超示宫内无残留物者为药物流产成功；若服药后1周内未见完整孕囊排出，B超提示宫内残留妊娠物者需行清宫术，常规病理提示绒毛残留者为药物流产失败。
2.负压吸宫流产方法：常规消毒铺巾，暴露宫颈，用宫腔探针测量宫腔深度，用宫颈扩张器依次扩张宫颈管，将吸管开孔处对着孕卵着床处，开动吸引器，负压升至400 mm Hg时，按顺时针方向转动吸引管吸尽宫腔内容物，再用小刮匙轻刮宫腔1周，术毕探测宫腔深度。
3.组织切片制作方法：药物流产成功者自行收集排出的妊娠产物，立即将新鲜绒毛及蜕膜组织用生理盐水漂洗除去血液后，置于10%甲醛中固定24 h。常规梯度脱水、浸腊、石蜡包埋，连续切片，每张组织切片厚约4μm。药物流产失败清宫和负压吸宫流产者，医生将吸出物过滤，取新鲜绒毛及蜕膜组织按上述方法处理。
4.PIBF及PR的表达：采用免疫组织化学染色（SP法）检测各组绒毛和蜕膜中PIBF（PIBF检测试剂盒购于美国Abbiotec公司）及PR的表达情况（PR单克隆抗体及二步法抗兔／鼠通用型免疫组化检测试剂盒，GK500710，购于基因科技上海有限公司），操作具体步骤按说明书进行。以磷酸盐（PBS）缓冲液（pH＝7.4）代替一抗做阴性对照。
5.结果判读：400×光镜下观察，阳性表达为细胞核或细胞质呈淡黄色至棕褐色。采用双盲法，对实验结果进行半定量判定：染色强度依次为0（无色）、1（淡黄色）、2（棕黄色）、3分（棕褐色）；染色范围以染色细胞所占的百分比评分，阳性细胞数≤25%为0分，26% ～50%为1分，51% ～75%为2分，＞75%为3分，计算染色强度和阳性百分比的乘积。每张切片取5个高倍视野，分别计算后取其平均值作为该张切片最终免疫组化结果，（－）为0分，（＋）为1～2分，（＋＋）为3～4分，（＋＋＋）为6分以上。
6.统计学处理：采用SPSS 19.0软件分析免疫组化结果，计量资料以（±s）表示，组间差异采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验，等级资料两两比较采用非参数Mann-Whitney U秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、母胎界面PIBF及PR表达情况
1.PIBF的表达：PIBF表达于绒毛合体滋养层细胞、细胞滋养层细胞和蜕膜细胞胞质，部分也表达于细胞核，见图1。与手术组相比，药流成功组和失败组绒毛组织中PIBF的表达差异无统计学意义；在蜕膜细胞中，药物流产的两组PIBF的表达明显下降，差异有统计学意义，且药流成功组PIBF的表达低于药流失败组，差异有统计学意义，见表2。
表2 3组绒毛和蜕膜组织中PIBF的表达［例（%）］
注：与手术组比较，*P＜0.01；与药流失败组比较，＃P＜0.05
药流成功组 30 绒毛 0 3（10.0）11（36.7）16（53.3）蜕膜2.PR的表达：PR仅表达于蜕膜组织细胞核，绒毛组织中未见阳性细胞，见图1。与手术组比较，药物流产的两组PR表达明显下降，差异有统计学意义，且药物流产成功组PR的表达明显低于药物流产失败组，差异有统计学意义。见表3。
表3 3组蜕膜组织中PR的表达［例（%）］
注：与手术组比较，*P＜0.01；与药流失败组比较，ΔP＜0.01
药流成功组讨 论
孕激素对于妊娠的发生与维持有重大作用，它通过与PR结合，从而在多种组织中发挥生物学效应，包括改变子宫内膜的分泌状态，创造良好的着床条件；抑制母体免疫反应，有效避免母体对胎儿的排斥；同时也能降低子宫平滑肌的收缩性［1］。目前研究得出，妊娠淋巴细胞对孕酮的敏感性明显增强，应用特异性孕酮多克隆抗体检测到淋巴细胞核有PR的表达，考虑其敏感性增高与PR相关［2］。健康的妊娠妇女外周血淋巴细胞表达PR［3］，且PR阳性的淋巴细胞数较非孕时明显增多，并随着孕周增长逐渐递增，说明淋巴细胞核PR的表达与妊娠维持相关。程玲慧等［4］研究发现，孕早期胚胎发育终止者血清P水平及蜕膜组织PR表达均低于正常早孕组，说明适当的血孕激素及蜕膜局部PR表达水平对维持成功妊娠有重要作用。既往研究表明胎盘组织中PR在绒毛和蜕膜细胞均有表达［5］，而本研究中PR仅表达于蜕膜组织细胞核，绒毛组织中未见明显的阳性细胞，这与前述观点稍有不符。Wang等［6］曾发现，使用不同的抗体，PR表达的部位也不一样，可能是由于抗体针对的PR片段不同所造成的。研究指出孕酮不仅仅通过与其内分泌受体结合发挥生物学效应，同样可以通过旁分泌和自分泌起作用［7］。这仍需要在今后的研究中进一步探究其原因及机制。
妊娠时胚胎对母体而言是半异己移植物，胚胎抗原的识别可以激活γδT细胞，使其表达PR，孕酮结合于淋巴细胞上阳性表达的PR后，可诱导淋巴细胞释放一种相对分子量34 kDa的蛋白质——PIBF，PIBF通过阻断磷脂酶A2而减少前列腺素的合成，并抑制人类蜕膜淋巴细胞释放穿孔素，有效降低自然杀伤细胞的活性，从而使妊娠顺利进展［8］。Check等［9］发现，29.5%未孕妇女外周血 T淋巴细胞表达PIBF，正常妊娠妇女则高达52.5%。另有研究指出妊娠早期若PIBF缺乏，可能导致流产率上升［10］。动物实验已证实，阻断孕酮受体可使PIBF产生减少，同时可降低封闭抗体的表达并提高胚胎吸收率［11］，而吸收的小鼠胚胎中PIBF的表达明显低于正常胚胎［12］。由此可知，PIBF在正常妊娠时表达较非孕期明显增加，并发挥重要的抗流产效应。本研究中正常早孕时PIBF表达于绒毛合体滋养层细胞、细胞滋养层细胞及蜕膜细胞胞质，且含量丰富，部分蜕膜细胞核上也可见阳性表达。
米非司酮是孕激素受体的拮抗剂，与PR结合能力是孕酮的5倍，能阻断孕酮与PR结合，抑制PR活化，从而使绒毛滋养层与蜕膜组织分离并剥脱。同时，米非司酮能增加蜕膜前列腺素释放，增强子宫肌层对前列腺素的敏感性，促进子宫收缩，并软化宫颈，有助于妊娠物排出，最终导致流产［13］。Salomon等［14］研究，服用米非司酮终止5～8周正常早孕时外周血淋巴细胞情况，PIBF阳性表达的淋巴细胞比例从服药前的52.8%明显下降至服药第2天的39.8%，指出米非司酮诱导的早孕终止与孕酮介导的免疫抑制功能紊乱密切相关。本研究中，使用米非司酮联合米索前列醇药物流产组与手术组相比，药物流产的两组绒毛组织中PIBF的表达差异无统计学意义，而在蜕膜细胞中，药物流产的两组PIBF、PR的表达明显下降，且药流成功组PIBF及PR的表达低于药流失败组。由此看出，米非司酮能够牢固地与PR结合，抑制PR活化，从而使蜕膜细胞中PR表达下降，导致蜕膜淋巴细胞产生的调节蛋白PIBF含量下降，最终导致流产，并影响流产的成功率。母胎界面中的PIBF作为一种妊娠保护因子，其表达降低将不能维持正常的妊娠，而在米非司酮作用下，PIBF表达降低，推测这也是药物流产中的一个重要的作用机制。
本实验的药物流产组患者除了服用米非司酮外，还需口服米索前列醇，PR水平的表达下降除了米非司酮的作用效应外，是否存在米索前列醇的继发作用，有待研究。蒋晓莉等［15］实验得出单用米索前列醇组PR表达与联合用药组差异无统计学意义，提示米非司酮本身可使PR表达水平下降。
图1 三组绒毛及蜕膜组织PIBF和PR的表达
注：A1～3药流成功组、药流失败组、手术组绒毛PIBF的表达（×400）；B1～3药流成功组、药流失败组、手术组蜕膜PIBF的表达（×400）；C1～3药流成功组、药流失败组、手术组蜕膜PR的表达（×400）
参考文献
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