叶酸与胎儿发育，心血管疾病及癌症等密切相关。叶酸受体（folate receptor，FR）是介导叶酸进入细胞的重要转运体，在母体胎儿叶酸传递过程中发挥重要作用［1］。研究报道，人体内存在叶酸受体自身抗体，该抗体不但与胎儿神经管缺陷（neural tube defects，NTDs）有关［2］，还可能与唇腭裂、女性不孕、孤独症、脑叶酸缺乏综合征等存在相关性［3～6］。尽管对叶酸受体自身抗体与NTDs的关系尚无定论，但叶酸受体自身抗体的发现为NTDs发生机制研究提供了一条崭新的思路，因此，需要建立可靠的叶酸受体自身抗体检测方法。
叶酸受体抗体的检测可通过放射性同位素标记法和酶联免疫吸附试验（ELISA）两种方法。放射性同位素标记法操作复杂并伴有同位素污染［2］。酶联免疫吸附试验方法检测灵敏度高，环境污染少［7］。但是如何获得人源的叶酸受体蛋白是酶联免疫吸附法需要解决的关键问题，因为牛源的叶酸受体与人源的叶酸受体虽有同源性但还存在差异，而且检测发现不同来源的叶酸受体蛋白结果差异很大［7］。目前商业化的只有牛源的叶酸受体蛋白，研究者曾尝试用基因克隆人工表达法获得人源叶酸受体蛋白，但是由于包涵体的存在，使纯化难以进行。若能够从人胎盘组织中提取纯化叶酸受体作为该ELISA实验中包被的抗原，可以优化现有的检测方法［8］。
本研究旨在建立一种从人体胎盘组织中提取纯化叶酸受体蛋白的实验方法，并对其进行定性定量的验证。
材料与方法
一、材料与仪器
本实验采用亲和层析柱（美国Sigma）、活性炭（美国Sigma）、蛋白检测试剂盒 Bradford Assay Kit（Thermo）、蛋白银染试剂盒 Pierce Silver Stan Kit（Thermo）、Triton X-100（中国香港 Farco）、聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶配制试剂盒（中国Sunbio）；电泳缓冲液（中国 Sunbio）、SDS-PAGE loading buffer-还原型（中国博奥森）、蓝色预染蛋白marker（中国 Sunbio）、FR一抗 C17（美国 Santa Cruz）、辣根酶标记兔抗羊IgG（中国Sunbio）和DAB kit（中国 Sunbio）。
实验仪器包括搅拌机（美国Philips）、均质匀浆器（德国 IKA Ultra Turrax-T18 Basic）、离心机（德国Eppendorf centrifuge 5810 R）、多功能酶标仪（美国Biotek Synergy2）和电泳仪（美国 Bio-Rad）。
二、方法
1.标本采集与处理：标本来自2011年4月1例在医院正常分娩健康产妇的胎盘，采集后－20℃转运，储存于北京大学生育健康研究所实验室－80℃冰箱。于2011年5月—2012年12月进行实验研究。
2.组织匀浆：胎盘用生理盐水冲洗3次，尽量洗净残留血液，称湿重；取2.5倍体积匀浆缓冲液（PBS，pH 7.2），用搅拌机将组织打成碎块，转入均质匀浆器中低温匀浆，4℃搅拌过夜。将匀浆液4℃，13 000×g离心30 min，合并上清液，备用。
3.酸化与中和：将上述上清液中用5N HCl调节溶液pH至溶液呈巧克力色，并加入7 g活性炭，4℃搅拌过夜。过夜的溶液加入17.4 g K2HPO4，用5N NaOH调节 pH至 7.6～8.0，13000×g离心30 min，合并上清液，备用。
4.过柱提纯：用 PBS／1%TritonX-100将亲和层析柱预平衡约20 min，换上上清液样品，待样品流完，此时蛋白已经结合在柱子上，依次更换溶液为PBS／1%TritonX-100，200 ml；PBS／1%Triton X-100／0.5M NaCl，200 ml；PBS 400 ml分别流完；醋酸洗脱液洗脱，4 ml离心管中加入160μl叶酸受体收集液（0.5M Na3PO4），每管收集 2 ml流分，上下混匀，收集8管，分别标记为 Fraction（Frac）1-Frac8。
5.组分鉴定：利用 Bradford方法检测 Frac1-Frac8各组分的蛋白含量。先将试剂盒中的牛血清白蛋白（BSA）标准品稀释至0.1 g／L，然后在 96孔板上，顺次加入 0、3、6、9、12、15和 18μl 0.1 g／L BSA制作标准曲线。取Frac1-Frac8各10μl，顺次加在96孔板上。每个标准品或样品孔加入80μl Bradford试剂，用缓冲液补充溶液至100μl。将96孔板振摇30 s，室温孵育10 min，检测595 nm吸光度值。根据标准曲线测出每样品孔的蛋白含量，依据蛋白含量鉴别出含有蛋白的组分，记录浓度及体积，4℃储存备用。
6.蛋白分子量检测：应用SDS-PAGE定性检测蛋白质分子量。首先配制SDS-PAGE分离胶及浓缩胶，将10μl 5x上样缓冲液和40μl样品混合后，煮沸4 min后骤冷变性。在lane1-5分别上样Ladder、Frac2、Frac3、Frac4和 Frac5。电泳，浓缩胶 100 V，15 min；分离胶120 V，60 min至溴酚蓝到达分离胶底部；小心剥离胶后，用Pierce Silver Stan Kit银染，对银染后的胶图拍照记录。
7.除杂：将含有叶酸受体蛋白的几个组分管合并，用 Millipore 3K滤器浓缩（离心 100 00 g，25 min）；将50μl除杂试剂Protein G-agarose离心除上清后加入到上述浓缩样品液中，混匀置于冰上，振摇2 h，除去杂质。用Millipore 100K滤器过滤（离心4 000 g，20 min），3K滤器浓缩（离心 100 00 g，25 min），最终得目的蛋白的纯品溶液。
8.除杂效果及蛋白含量测定：按照上述同样方法将样品用SDS-PAGE电泳和银染以鉴定除杂效果；用上述Bradford Protein Assay方法再次测定蛋白含量，记录目的蛋白的终浓度及体积。
9.蛋白定性验证：应用Western Blot方法进行目的蛋白的定性鉴定。首先将样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，小心剥离凝胶，切下含有目的蛋白条带的胶块，然后将目的蛋白条带电转入PVDF膜（湿式过夜电转），次日用5%BSA封闭，置于培养皿中，加入叶酸受体一抗C17（1∶1 000稀释），缓慢振荡孵育2 h。膜在PBST中漂洗2次，每次15 min；然后加入二抗辣根酶标记兔抗羊IgG（1∶5 000稀释）缓慢振荡孵育1 h；DAB显色。
结 果
一、粗提物蛋白定量结果
根据BSA标准蛋白的标准曲线和各组分的吸光度值，得出 Frac1-Frac8的蛋白浓度。Frac1和Frac6-Frac8没有蛋白存在，Frac2-Frac5存在浓度为2.8～107.8 mg／L的蛋白，其中蛋白主要在 Frac3中洗脱出来，见表1。由于每组分2 ml，Frac2-Frac6的蛋白含量可估算为5.6～215.6μg。粗提物总蛋白含量为354.6μg，用于本实验的胎盘湿重370 g。
表1 粗提物各组分的蛋白含量
Frac1 0 2 0 Frac2 25.0 2 50.0 Frac3 107.8 2 215.6 Frac4 41.7 2 83.4 Frac5 2.8 2 5.6 Frac6 0 2 0 Frac7 0 2 0 Frac8 0 2 0二、粗提物SDS-PAGE电泳结果
将上述Frac2-Frac5进行SDS-PAGE电泳后银染，图1显示的是人胎盘组织叶酸受体蛋白粗提取物的SDS-PAGE电泳银染胶图，可见在35～40 KDa蛋白分子量之间，Frac2-Frac4有清晰的蛋白条带，而Frac5由于蛋白含量低，条带不清。文献报道［9，10］的叶酸受体蛋白大小为 38～40 KDa，可初步判断此条带为叶酸受体蛋白。然而从图中还见到在55和90 KDa有一些蛋白条带，可能为杂质蛋白，需要进一步实验弃除。
三、精提物SDS-PAGE电泳结果
将Frac2-Frac5蛋白溶液合并后，进行化学和物理方法的除杂，经除杂后的精提物蛋白SDS-PAGE电泳银染胶图见图2。为了对比，lane2是除杂前的蛋白溶液，lane1和lane3显示的是除杂后的蛋白条带，可见lane2中的55 KDa和90 KDa蛋白条带在lane1和lane3中消失。
四、精提物Western Blot鉴定
经除杂后的蛋白含量检测为345μg。为了进一步对纯化蛋白进行验证，本研究进行Western Blot定性检验。图3显示的是人胎盘叶酸受体蛋白Western Blot印迹图，实验所用的一抗可与人源FR特异结合。经过Western Blot验证，提取的蛋白就是叶酸受体蛋白。
讨 论
本研究成功从人胎盘中提取并纯化人源的叶酸受体蛋白，每100 g胎盘可提取叶酸受体蛋白93μg，蛋白分子量约为35～40 KDa。
本实验取材的胎盘湿重370 g，粗提物总蛋白含量约为355μg，经纯化后的蛋白含量为345μg。首先采用可与叶酸受体蛋白特异结合的琼脂糖胶体，将胎盘匀浆液中的叶酸受体蛋白特异结合到柱上，除盐后洗脱下来得到粗提物，经鉴定目的蛋白在组分2～5中被洗脱出来。此时的粗提物含有55 KDa和90 KDa的杂质。经分析粗提物中伴随的杂质可能是与叶酸受体蛋白结合的IgG，故采用可与IgG结合的 Protein G-agarose，进行化学除杂；然后用100 K的分子筛将结合与Protein G的杂质去除，得到纯化蛋白。本研究在精提过程中同时采用了化学和物理两种方法进行除杂，保证了蛋白的高纯度。
对目的蛋白的鉴定，本研究采用SDS-PAGE胶银染法和Western Blot两种方法。在SDS-PAGE电泳银染胶图上可见提取的目的蛋白分子量在35～40 KDa之间，与文献报道的叶酸受体蛋白大小（38～40 KDa）相吻合［9，10］。进一步进行 Western Blot验证，一抗采用的是sigma公司的FR（C-17），可特异结合人源FRC末端片段。Western Blot转印膜图证明提取的蛋白可与FR（C-17）特异结合，结合分子量结果可确证本实验所提蛋白就是叶酸受体蛋白。
本实验所提取的人源叶酸受体蛋白可以用于检测叶酸受体自身抗体IgG和IgM水平，也可用于叶酸Blocking的叶酸受体自身抗体检测方法中。目前国际上，出生缺陷等相关领域研究只能采用商业化的牛源叶酸受体蛋白代替人源叶酸受体蛋白，研究结果难以描述人体相关指标的水平［7，11，12］，本课题提取到的高纯人源叶酸受体蛋白可以弥补这方面的不足，不但具有较强的科学意义，还具有较高的应用价值。
［致谢：本研究得到美国德州大学（奥斯汀分校）的Richard H.Finnell教授、Zhu Huiping教授和Johnathan L.Ballard博士的大力支持与热心帮助，特此感谢！］
图1 粗提物SDS-PAGE电泳银染胶图
图2 精提物SDS-PAGE电泳银染胶图
图3 精提物Western Blot鉴定
参考文献
1 Antony AC.The biological chemistry of folate receptors.Blood，1992，79：2807-2820.
2 Rothenberg SP，da Costa MP，Sequeira JM，et al.Autoantibodies against folate receptors in women with a pregnancy complicated by a neural-tube defect.N Engl JMed，2004，350：134-142.
3 Ramaekers VT，Rothenberg SP，Sequeira JM，et al.Autoantibodies to folate receptors in the cerebral folate deficiency syndrome.N Engl J Med，2005，352：1985-1991.
4 Bliek JB，Rothenberg SP，Steegers-Theunissen RP.Maternal folate receptor autoantibodies and cleft lip and／or palate.Int JGynaecol Obstet，2006，93：142-143.
5 Ramaekers VT，Blau N，Sequeira JM，et al.Folate receptor autoimmunity and cerebral folate deficiency in low-functioning autism with neurological deficits.Neuropediatrics，2007，38：276-281.
6 Berrocal-Zaragoza MI，Fernandez-Ballart JD，Murphy MM，et al.Association between blocking folate receptor autoantibodies and subfertility.Fertil Steril，2009，91：1518-1521.
7 Cabrera RM，Shaw GM，Ballard JL，etal.Autoantibodies to folate receptor during pregnancy and neural tube defect risk.JReprod Immunol，2008，79：85-92.
8 王琳琳，任爱国.叶酸受体抗体与出生缺陷.中国生育健康杂志，2011，22：60-61，64.
9 Basal E，Eghbali-FatourechiGZ，Kalli KR，etal.Functional folate receptor alpha iselevated in the blood of ovarian cancer patients.PLoS One，2009，4：e6292.
10 O’Shannessy DJ，Somers EB，Albone E，etal.Characterization of the human folate receptor alpha via novel antibody-based probes.Oncotarget，2011，2：1227-1243.
11 Bille C，Pedersen DA，Andersen AM，et al.Autoantibodies to folate receptor alpha during early pregnancy and risk of oral clefts in Denmark.Pediatr Res，2010，67：274-279.
12 Boyles AL，Ballard JL，Gorman EB，etal.Association between inhibited binding of folic acid to folate receptor alpha in maternal serum and folate-related birth defects in Norway.Hum Reprod，2011，26：2232-2238.