荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）是近年来兴起的分子细胞遗传学方法，被认为是诊断染色体异常的一个新技术。本研究采用FISH技术对100例早期自然流产绒毛细胞13、16、18、21、22、X／Y号染色体进行检测，同时检测自然流产夫妇双方的叶酸水平，结合绒毛染色体结果，探讨二者间关系。
对象与方法
1.对象：2011年7月－2012年7月到长治市妇幼保健院妇产科就诊的年龄在25～30岁的孕早期自然流产妇女100例作为病例组。同时选取相同年龄段的正常孕早期妊娠妇女100例作为对照组。所选病例均有停经史伴或不伴阴道流血，并经B超检查提示胚胎停止发育或死胎。实验经院伦理委员会审批，所有病例均签署知情同意书。
2.自然流产诊断标准：（1）反复性阴道出血，时多时少，妊娠反应消失；（2）尿妊娠试验阴性；（3）B超检查时子宫小于停经月份或胚胎停止发育。
3.FISH检测：取新鲜流产或胎儿组织（胎儿组织可以选取肌肉，最好去掉皮肤，避免角质成分的影响），用生理盐水洗净。无菌剪刀或镊子去掉蜕膜组织，选取绒毛或其他组织，剪碎，该操作可在显微镜下进行（注意避免母体细胞污染）。取标本约3～5 mg，加入5 ml预热至37℃的0.075 mol／L KCl溶液，37℃低渗20 min，期间轻轻吹打悬浮细胞1～2次。缓慢加入2 ml固定液（甲醇∶冰乙酸＝3∶1），轻轻吹打混匀后1800转／分（560×g），离心10min。去上清，加入5 ml固定液，混匀，期间吹打1次，1800转／分，离心10 min。重复固定一次。去上清，加1 ml冰醋酸消化约1 min，加3 ml甲醇终止消化。离心，去上清，根据细胞量加适量固定液混匀后滴片，56℃烤片30 min以老化玻片，室温干燥保存。按FISH检测试剂盒（北京金菩嘉医疗科技有限公司）提供的荧光原位杂交操作说明进行操作。探针种类为 GLP13／GLP21、GLP16／GLP22、CSP18／CSP X／CSP Y。将制备好的玻片进行漂洗、消化、脱水后变性，42℃杂交16 h，洗片、复染后在荧光显微镜下观察、分析杂交信号。
4.自然流产绒毛染色体核型分析：常规细胞培养并进行G显带技术［1］，每个样本计数30个分裂相，分析5个核型。
5.叶酸含量检测：抽取男女双方静脉血液5 ml（空腹），用叶酸检测试剂盒（美国贝克曼库尔特有限公司）在贝克曼全自动化学发光仪上测定含量。
6.结果判读：采用Nikon ECLIPSE 80i型正置荧光显微镜观察，图像由JENOPTIK（ProgRes MF-cool）冷 CCD采集，以 VideoTest－FISH 2.0软件进行分析。每组探针计数至少100个细胞，单独判断每种指标。比较信号大小和强度，两个进行统计的信号之间至少相隔一个相对小信号直径进行区别。重叠的或缺乏明确界线的信号不予统计。如核中荧光信号有分裂、相互交叉或并排的现象，当距离小于信号大小一半时记录为一个信号。某指标异常细胞比例大于60，结果判读为异常；单个指标异常细胞比例均小于10，结果判读为正常；某种指标异常比例介于10%～60%之间，加大观测样本细胞数目，如实记录异常细胞比例。
7.统计学处理：采用SPSS 13.0进行统计分析。运用t检验进行组间叶酸含量的比较，χ2检验进行两组间率的比较。
结果
1.FISH检测结果：100例自然流产绒毛组织FISH杂交成功率100%，染色体数目异常检出率40.0%（40／100）。40例检出异常的病例中，常见异常类型有常染色体三体占异常发生总数比75.0%（30／40），其中 16号染色体三体、22号染色体三体和13号染色体三体分别占35.0%（14／40）、25.0%（10／40）和 15.0%（6／40）；X染色体单体占7.5%（3／40）；三倍体占17.5%（7／40）。
2.绒毛染色体核型分析：对100例病例组标本进行绒毛染色体核型分析，成功98例，2例因细胞克隆少而无法进行显带检测。且耗时较长。
3.FISH检测结果与绒毛染色体核型分析结果比较：FISH检测结果与染色体核型分析结果比较，符合率达到88.0%［（40＋48）／100］。有12例结果不一致，其中10例因FISH探针未涉及的染色体异常引起，2例绒毛染色体核型分析结果为正常而FISH检测为16－三体。两种检测方法的吻合度较强，FISH方法诊断流产绒毛染色体数目异常快速、准确、高效。见表1。
表1 FISH检测结果与绒毛染色体核型分析结果比较
异常
40 2 42正常 10 48 584.叶酸含量检测结果：病例组男女体内叶酸均低于对照组叶酸含量，差异有统计学意义；经FISH检测核型异常组男女血清叶酸与核型正常组男女血清叶酸含量相比，差异有统计学意义，见表2。
表2 不同组别叶酸含量检测结果
*与对照组男性体内叶酸含量相比，P＜0.05；＃与对照组女性体内叶酸含量相比，P＜0.05；※与核型正常组男性体内叶酸含量相比，P＜0.05；▲与核型正常组女性体内叶酸含量相比，P＜0.05
病例组男100 11.7±1.9讨论
导致自然流产的原因较多，如遗传基因缺陷、母体因素、胎盘内分泌功能不足、环境因素、免疫因素等［2］，其中遗传基因缺陷导致自然流产时，多为三体、三倍体及X单体等染色体数目异常，其次为断裂、倒置、缺失和易位等染色体结构异常。遗传基因缺陷的胚胎多数结局为自然流产，极少数可能继续发育成胎儿，但出生后也会发生某些功能异常或合并畸形。国外数据表明［3］，孕妇前3个月、中3个月、后3个月自然流产染色体异常率分别为60%、10%～20%、5%～10%。其中较为常见的染色体异常有X单体、16号染色体三体、18号染色体三体、21号染色体三体和22号染色体三体，发生率约为5%。通过检测这些自然流产胎儿的常见染色体异常情况，可以为下一代妊娠进行遗传咨询提供资料。如果孕妇自然流产是由于染色体异常引起的，那么下一代有染色体异常的风险较普通人群高。
FISH技术是目前国际上比较先进的检测染色体异常的方法，其灵敏度高，所需细胞量少，无需培养，技术容易被掌握。从标本的制备到原位杂交结果分析完成可在48 h内完成，比常规的G－显带染色体核型分析快得多，且有较好的灵敏度及特异度。本组资料FISH检测成功率100%，检测阳性率40.0%，与文献报道一致［4-6］。
叶酸是人体必需的维生素，参与核酸、氨基酸、蛋白质及磷脂的代谢，对DNA和RNA的合成、细胞增殖和组织生长各有重要意义，孕妇由于需要量增加及较非孕妇女生理机能出现很大变化等原因，容易发生叶酸缺乏，造成一系列病理生理改变［7］。大量资料证明孕妇血液叶酸水平比非孕人群有不同程度下降，且随孕周增加而降低，于孕末2周下降最显著，缺乏率随孕周增加而上升。有关资料研究显示叶酸缺乏可能是导致自然流产的危险因素［8］。本研究中，研究组与对照组相比男女双方体内叶酸含量差异有统计学意义，且异常核型者男女双方体内叶酸含量与核型正常者相比差异也有统计学意义，由此可推断血清叶酸水平低下与染色体异常有关，可能与体内叶酸水平降低后，叶酸的代谢途径出现障碍，其代谢通路中向甲硫氨酸转化出现障碍，引起S－腺苷甲硫氨酸与S－腺苷同型半胱氨酸比值降低，抑制DNA甲基转移酶活性和DNA甲基化，造成染色体改变有关［9］。
本次研究发现FISH技术诊断染色体异常符合率达到88.0%。而且FISH技术能够快速、准确、高效地检测自然流产或死胎染色体异常情况，临床应用前景十分广阔。今后，可适当增加样本量，更深入研究血液叶酸水平与自然流产危险性之间的关系。为优生优育、减少出生缺陷、提高人口素质提供科学依据。
参考文献
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4 孙庆云，周丽颖，兰永连，等.自然流产的遗传学检测及相关病因学研究.中国优生与遗传杂志，2011，19：36-37.
5 崔洪艳，陈叙，岳天孚.FISH技术检测自然流产或死胎死产组织中染色体异常的临床研究.中国妇幼保健，2011，26：5220-5221.
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7 周艳红.血清同型半胱氨酸及叶酸与出生缺陷的关系.长沙：中南大学，2006.
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9 朱静.叶酸、核黄素缺乏及亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性对人类遗传物质稳定性的影响.昆明：云南师范大学，2006.