高龄孕妇唐氏综合征筛查和诊断的研究进展

高龄孕妇（advanced maternal age，AMA）是指分娩年龄大于或等于35周岁的孕妇。AMA对妊娠结局的影响主要表现在以下几个方面：生育能力降低、自然流产率增加、胎儿染色体异常、妊娠期高血压疾病和胎死宫内的发生率增加［1］。产前诊断是指在胎儿出生之前应用各种先进的检测手段，如影像学、生物化学、细胞遗传学及分子生物学等技术，了解胎儿在宫内的发育状况，观察胎儿有无畸形，分析胎儿染色体核型，监测胎儿的生化项目和基因等，对先天性和遗传性疾病作出诊断，为胎儿宫内治疗（手术、药物、基因治疗等）或选择性流产提供依据［2］。

高龄孕妇的产前筛查和诊断策略经历着变化。2001年美国妇产科医师协会（ACOG）建议对35岁以上的高龄孕妇均进行介入性产前诊断［3］；加拿大妇产科医师协会（SOGC）表明妊娠年龄超过40岁可直接进行羊膜腔穿刺或绒毛穿刺［4］；中国2001年母婴保健法实施办法及2002年产前诊断技术管理办法也明确规定：对于高龄产妇应进行产前诊断。然而，随着母体血清学筛查的进步与完善，2007年ACOG指出对孕妇的选择进行的研究表明，孕妇对于这些潜在的结果有不同的考量，且决定是否提供侵入性诊断应该考虑她们的选择而不应该仅仅基于年龄，因而无论孕妇年龄（Maternal age，MA）大小，应对所有孕妇进行产前筛查［5-6］。中国学者已有文献支持先对高龄孕妇进行无创性产前筛查，特别是唐氏综合征（down’s syndrome，DS）的产前筛查，根据筛查结果再行有创性的产前诊断［7］。高龄孕妇产前筛查的必要性正受到肯定。

一、DS的筛查及诊断方法

DS又叫做21三体综合征，先天愚型，是说患者的第21对染色体比正常人多出一条（正常人为一对），是最常见的胎儿染色体异常综合征。多年来，许多研究者都在努力探索如何提高该疾病的诊断水平。现将近几年来相关的研究结果归纳如下。

1.产前筛查：血清学筛查可分为早孕期和中孕期，而孕中期又有二联、三联、四联筛查之分，除此之外，遗传学超声检查，尤其是早孕期的胎儿颈项透明层厚度（NT）检测也常常与母体血清学筛查结合运用。早孕期（11～14周）MA对胎儿DS的检出率可达30%～50%；采用MA、游离人绒毛膜促性腺激素β-亚单位（β-HCG）和妊娠相关的血浆蛋白A（PAPP-A）检出率可达60% ～63%；而采用 NT、PAPP-A、β-HCG、MA相结合，检出率能达到86%～90%；联合筛查加鼻骨、三尖瓣血流、静脉导管和面部角度可使检出率达95%［8，9］。近年来，孕15～19周从二联［甲胎蛋白（AFP）＋β-HCG］筛查到三联［AFP＋β-HCG＋游离雌三醇（uE3）］筛查再到四联［AFP＋β-HCG＋uE3＋抑制素-A（Inhibin-A）］筛查，检出率不断提高。尚有研究利用早、中孕结合序贯筛查以提高DS检出率［10］。超声筛查胎儿染色体三体的价值则包括两个方面：其一，胎儿解剖结构畸形，畸形部位越多，其患21三体的风险越大。其二，出现“超声软标志”，胎儿患染色体病的风险增高，超声软标志包括NT或颈项软组织厚度（NF）增厚、肢体短小、侧脑室增宽、脉络丛囊肿、肠管回声增强、肾盂轻度扩张和单脐动脉等。

2.创伤性产前诊断方法：（1）孕早期绒毛穿刺活检（CVS）。现在常规推荐CVS应在10周之后进行，流产风险约1%［11］。虽然是一种创伤性操作，但因其具有孕周小、时间短、母体细胞污染率低等优点，仍然是目前产前诊断常用的一种方法。而且，即使实验失败或有疑问，中期妊娠羊水或脐血培养可做补救和验证［12］。（2）孕中期羊膜腔穿刺术。最佳穿刺时期为妊娠16～20周，一些穿刺及培养技术条件先进的机构或医院已将其穿刺及培养时间成功延长至25～30周，流产风险约 0.5% ～1%［11］，是目前产前诊断中主要的、可靠的方法。羊水胎儿细胞染色体核型分析是产前诊断最准确和最全面的诊断方法，传统G-显带法是诊断的金标准，但培养时间较长，最快也要2周时间。而荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）和荧光定量PCR（quantitative fluorescence PCR，QF-PCR）可为95%以上的患者1～3 d内提供准确的结果，在快速诊断的同时也是常规核型分析的一个补充。但它们只能用于诊断目标染色体的数目异常，而不能检查其它染色体异常和染色体结构异常，因此，不能代替传统的核型分析。（3）孕中晚期脐带血穿刺术。最佳时间为26～30周，流产风险约1%［11］，同羊膜腔穿刺术一样，是进行核型分析的侵入性检查，是产前诊断的金标准。

3.无创性产前诊断：（1）孕妇外周血胎儿细胞。从孕妇外周血中获取胎儿细胞是非创伤性产前诊断中颇具前景的方式，其中，胎儿有核红细胞（FNRBC）被公认为是比较好的胎儿遗传物质来源［13］。从第6孕周开始直至胎儿分娩，FNRBC持续存在于母血循环中，且期循环周期短（约为90 d），增殖能力有限，不会持续到下次妊娠［14］。目前胎儿有核红细胞的分离和富集方法主要有：密度梯度离心法、荧光激活细胞分离术即流式细胞术（FACS）、磁珠细胞分选法（MACS）、电荷流分离法（CFS）和亲和素分离法。现今在染色体水平，主要用荧光原位杂交（FISH）诊断21-三体、18-三体、Klinefelter综合征和 47，XXY等染色体病［13］。另外，有学者［15］建立了一个快速诊断模式，分两个步骤：第一步是采取血清三联唐氏筛查、B超影像学检查结合病史筛选唐氏高危孕妇，当日采集标本，分选处理；第二步是应用多重引物原位杂交（multi-primed in situ labeling，multi-PRINS）方法进行染色体检测确诊。由于母体外周血中胎儿有核细胞极少，每毫升血中仅有1～2个［16］，其分离、富集方法繁琐复杂，且价格昂贵，故临床难以应用。（2）孕妇外周血胎儿遗传物质。1997年，Lo［17］以孕男胎妇女作为研究对象，用快速煮沸法从孕母血浆及血清中提取DNA，首次证明了孕妇外周血中游离胎儿DNA的存在。基本特性：①早期和晚期妊娠含量是胎儿细胞DNA的970倍和775倍［18］；②从妊娠第5周开始即可检出［19］；③妊娠后血浆胎源性DNA分子较母源性长度短很多（99%的胎儿游离DNA＜313 bp，其中80%＜193 bp），这使从母体血浆中提取、分离胎儿DNA更容易、便捷［20］；④分娩后2 h就无法检出［21］。分离与检测：最近的一则报道［22］显示，胎儿游离DNA片段富集甲基化已被证明，因而通过甲基化DNA免疫沉淀法可成功检测21三倍体异常。细微变化可被高通量测序技术精确检测出［23］。而且许多学者为开发一种新颖的生化分析和算法来评价胎儿21-三体和18-三体的风险进行了大量的病例对照研究，从而可使21-三体和18-三体的检出率分别达到100%和98%［24-26］。最近研究的产前细菌人工染色体标记-磁珠分离法（bacterial artificial chromosomes-on-BeadsTM，BoBsTM）使得在单个孔内进行分子核型分析成为可能。另外，产前BoBsTM属于快速产前诊断范围，且需要的DNA量非常少，是一种可靠的试剂盒。胎儿游离mRNA的应用：Go等［27］首先发现了母血浆中存在21号染色体特异表达mRNA片段LOC90625，这为通过定量检测mRNA的表达异常来筛查唐氏综合征提供了可能。Lo等［28］也在母血浆中发现了位于21号染色体上胎盘特异表达的PLAC4基因片段。且有学者利用mRNA-单基因多态性等位基因比率（mRNA-SNP allelic ratio）分析方法，对孕有21-三体胎儿的母亲外周血中特异性胎盘来源的PLAC4 mRNA进行检测。尽管胎儿游离DNA具有众多的检测和诊断优势，但仍存在一些问题有待解决，如胎儿游离DNA的来源及清除机制仍不甚清楚，并且需要寻找更多的胎源性DNA标记物来诊断临床相关疾病［29］。

二、高龄孕妇唐氏综合征筛查与诊断的综述

综上所述，对高龄孕妇唐氏综合征筛查的方法与手段有巨大进步，包括早孕期联合筛查、中孕血清学筛查、超声筛查和无创性产前检测技术。早孕期联合筛查中NT有较高的诊断价值。而中孕血清学筛查方案有二联、三联和四联之分，且检出率不断提高。另外，孕中期超声大排畸检查，是遗传学超声对唐氏综合征产前筛查的重要贡献。而新兴的无创性产前检测技术因其对唐氏综合症的检出率可达到99%，使得它成为诊断唐氏综合征的一个重要补充，由于其对双胎、多胎以及一些特殊类型的21-三体（如嵌合体、易位型、环形）则不能检测，因而是属于近似于诊断水平的筛查方法。

而产前诊断技术则有孕早期绒毛穿刺活检、孕中期羊膜腔穿刺术和孕中晚期脐带血穿刺术。目前，中国对于高龄孕妇一般建议直接在适当的孕周进行羊水穿刺和胎儿染色体检查。但因其有一定的流产等风险，所以实际工作中真正愿意主动进行羊水穿刺的高龄孕妇只是极少数。对这些不愿意进行羊水穿刺的孕妇，可在充分告知各种筛查技术的优势与不足之后让其自行选择筛查与诊断方法，并根据其筛查结果在医生指导下进行下一步的遗传咨询与诊断。

三、现状与展望

产前诊断对于高龄孕妇唐氏综合征的预防有着至关重要的作用，各种产前诊断方法又有其适用时间及风险。目前鉴于对筛查技术的不确定性和对侵入性诊断方式的恐惧心理，孕妇开始寻求一种更为简单有效的方式来解决她们所面临的困境。而无创性产前诊断的出现为我们开辟了新的道路。当务之急是如何选择最佳的产前诊断方案，结合产前筛查与产前诊断的优势更好地对高龄孕妇进行产前诊断，最大限度地检出染色体异常儿，尽可能降低介入性产前诊断率，逐步完善无创性产前诊断技术。

众所周之，无创DNA产前检测技术市场前景巨大，支撑这巨大前景的磐石必然是技术革新带来的高准确度，也是众多孕妇所关注的焦点。在未来的几年，随着无创DNA产前检测技术的推广和二代测序技术的成本降低，接受和愿意尝试无创DNA产前检测服务的人群越来越大，检测的临床样本越来越多，检测涵盖的内容也越来越丰富，如何在样本“量”的前提下，保证技术的“质”，是中国首要面临的考验。

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