自1978年世界上第1例试管婴儿诞生以来，辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）已经被全世界绝大多数国家所承认和应用，并被认为是20世纪对人类有重大贡献的技术发明之一。但ART治疗带来的低种植率和高多胎妊娠率给母婴都造成了生理上的风险并使患者家庭承受较高的疾病负担。为了提高种植率，在胚胎移植中常移植超过1个以上来获得较高的妊娠率，由此带来了多胎妊娠，而既往研究已明确指出多胎妊娠会给母婴带来诸多危害，如孕母的妊娠期高血压疾病、妊娠合并贫血，胎儿的宫内窘迫、生长迟缓、早产、低出生体重等［1］。近年来选择性减胎术在全球范围的推广有助于降低多胎妊娠带来的危害并且研究显示单胚胎移植不降低累积妊娠率［2］。通过选择性单胚胎移植使母婴结局得到改善，减少新生儿围生期并发症，降低患者的经济成本，能获得更多的社会效益。但目前评估胚胎的方法大多采用胚胎形态学评分及卵裂率，其在评估胚胎活力和预测继续妊娠方面有一定的局限性。本次研究采用拉曼光谱技术检测胚胎培养液中丙酮酸，通过受试者工作曲线评估丙酮酸对胚胎质量选择的价值。
对象与方法
一、对象
2011年10月—2012年4月来本院生殖中心不孕诊疗中心因输卵管堵塞，男性精子活力低下、少精等，排除多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症或子宫肌腺瘤、宫腔畸形、明显的输卵管积液或宫腔积液导致不孕患者共34例，年龄28～43岁。入选患者均采用常规促排卵及体外受精（in vitro fertilization，IVF）助孕治疗以获得卵母细胞。获得的卵母细胞在37℃及5%CO2条件下培育4～6 h后受精。受精后第3天观察胚胎卵裂数，并对其形态学评分，同时取第3天胚胎培养液，备用拉曼光谱检测。根据评分移植A＼B级胚胎，并给与黄体支持。同时取第3天培养液，－80℃冻存。移植后14 d测血hCG，移植5周后超声检查，发现宫内有孕囊者诊断为临床妊娠。收集患者胚胎培养液34份，选择性单胚胎移植妊娠成功11例，未妊娠者23例。两组年龄、不孕年限、不孕原因、移植日雌二醇水平（estradiol，E2）和移植日子宫内膜厚度比较，差异均无统计学意义，见表1。
表1 两组基本情况比较
二、方法
1.胚胎细胞形态学评分：将胚胎按细胞数和碎片程度分成3个等级［4-5］，A级胚胎细胞数≥7个，无细胞碎片且细胞大小均一；B级胚胎细胞数≥7个，细胞碎片量≤10%或细胞大小不均；C级胚胎细胞数＜7个或细胞碎片在10%～50%。
2.拉曼光谱检测丙酮酸含量：根据胚胎培养液的营养物质和既往研究［3］报告，拉曼位移设置范围为600～1 800 cm-1。既往研究发现丙酮酸的分子结构属Cs对称点群，共有原子数10个，存在24个震动模式，其对应的最强谱线频率为1 425 cm-1［6］，本次拉曼光谱在此频率值设定为丙酮酸的拉曼散射强度。冻存培养液在室温25℃解冻15 min，确保样本完全融化后涡旋混匀。使用B＆WTeki-Raman拉曼仪釆集其拉曼光谱。取10μl样品滴于锡箔纸上，使用仪器自带显微镜将拉曼光斑聚焦于样品上，在激发波长785 nm、激发光强度100%、扫描时间60 s的条件下测量胚胎培养液的拉曼光谱，每个样品重复采集3次光谱并计算丙酮酸与白蛋白拉曼散射强度比值的平均值作为最终结果。测量结束后更换新的锡箱纸在同一条件下进行另一样品的测量。
3.统计学处理：采用SPSS 17.0软件统计。年龄、不孕年限、E2值为正态分布资料，以均数±标准差表示，采用t检验；丙酮酸与白蛋白拉曼散射强度比为非正态分布，用中位数（M）［四分位数（P25、P75）］表示，采用秩和检验分析。所有分类变量采用χ2检验和Fisher精确概率法。评估丙酮酸的预测价值时，以丙酮酸／白蛋白拉曼强度比值和形态学评分为自变量，以是否妊娠为因变量做多变量Logistic回归，并计算根据两个自变量得到的概率值Y；以回归方程估计值Y为自变量，以妊娠为结局变量的状态值做受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）。P＜0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、拉曼光谱结果
本次研究各个样本之间的变异较大，故计算每一个样本的丙酮酸与白蛋白的比值。妊娠组和未妊娠组丙酮酸与白蛋白拉曼散射强度比值分别为0.0090（0.0070～0.0189）和 0.0238（0.0183～0.0325），四分位间距分别为0.0119和0.0142，两组差异有统计学意义。
二、受试者工作曲线ROC
1.形态学评分的ROC：以形态学评分为自变量，以妊娠为结局变量的状态值做ROC曲线，得到曲线下面积（area under the curve，AUC）为0.582±0.052，95%CI：0.481～0.683，P＝0.117，见图1。
2.丙酮酸和形态学评分综合的ROC：以丙酮酸／白蛋白拉曼强度比值和形态学评分为自变量，以是否妊娠为因变量做多变量Logistic回归，并计算根据两个自变量得到的概率值Y（见表2）；以回归方程估计值Y为自变量，以妊娠为结局变量的状态值做ROC曲线，得到 AUC为0.846±0.036，95%CI：0.775～0.916，P＜0.001，见图1。据此 ROC可得在最优点时，利用丙酮酸和形态学评分综合预测妊娠成功的敏感度为72%，特异度84%。
表2 丙酮酸和形态学评分综合预测妊娠率的Logistic回归
图1 不同方法预测单胚胎移值妊娠率的受试者曲线下面积图
讨 论
本次研究通过拉曼光谱检测胚胎培养液中丙酮酸的含量，并以此估计其预测单胚胎移植成功率的能力。通过ROC曲线研究发现，单纯使用形态学评分估计单胚胎移植妊娠成功率的能力较弱，曲线下面积仅为 0.582，95%CI：0.481～0.683，说明其并不适合用来预测单胚胎移植妊娠成功与否；通过形态学评分加丙酮酸含量共同预测单胚胎移植妊娠率，曲线下面积达 0.846，95%CI：0.775～0.916，说明其可以较好地估计单胚胎移植妊娠率。
随着中国生殖医学的迅速发展，预防胚胎移植过程中多胎妊娠的发生对于提高母婴安全，减低卫生经济学成本具有重要的意义。虽然形态学评分从其被发现开始即对移植胚胎的选择具有重要的意义，但其主观性因素始终是不可忽略的弊端［7，8］。近年来随着物理技术的进步，各种新的方法已经引入到生殖医学中，特别对于胚胎选择方面重要标志物的检测有着非凡的意义［9］。其中胚胎营养液中代谢物的含量引起了各国科学家的强烈兴趣。目前检测的方法包括质谱分析技术（mass spectrometry，MS）、核磁共振波谱分析技术（nuclear magnetic resonance，NMR）、高效液相色谱（High performance liquid chromatography，HPLC）、拉曼光谱分析技术（Raman spectroscopy）等［11］。而拉曼光谱法以分子震动信息为基础，因为水只产生极其微弱的信号，所以该法特别适用于液体内某物质的检测［12］。
生理学研究发现，在早期卵裂期，丙酮酸是主要的胚胎能量物质，葡萄糖在胚泡期才转化为主要能量来源［13］。既往研究［1］认为胚胎营养介质中丙酮酸消耗量是胚胎活性和生长潜能的主要指标。输卵管和子宫液中含有大量自由氨基酸，是胚胎营养的重要调节物质，参与细胞生物合成，参与碳水化合物代谢和细胞渗透压和pH值调节［14］。培养介质是胚胎在体外生长所接触的最直接的环境，因此分析胚胎培养介质是一种无创的、客观的预测发育潜能的方法。Seli等［15］和 Scott等［16］通过拉曼光谱技术检测胚胎培养液中硫氢键-SH、碳氢键-CH、氮氢键-NH，发现在成功妊娠组和非成功妊娠组存在差异。而本次研究进一步用ROC曲线的方法揭示了在胚胎培养液中，丙酮酸可良好预测胚胎移植后的妊娠率，对于临床有较高的指导意义。
因此，在选择性单胚胎移植胚胎筛选中，使用拉曼光谱法检测胚胎培养液中丙酮酸的含量，并将其与形态学评分结合可选择优质胚胎，提高胚胎移植妊娠成功率。
参考文献
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