乙肝病毒(HBV)持续感染是一个严重的公共卫生和社会问题。全世界有约20亿人感染过乙肝病毒，其中约3.5亿人处于慢性感染状态[1]，10%～30%会发展为慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌[2]。中国慢性乙型肝炎是引起肝硬变和肝癌最常见的原因。乙型肝炎慢性化的机制主要是由于机体免疫功能低下，不能产生针对HBV的特异性的细胞毒性T淋巴细胞反应(TCL反应)，因而不能有效清除HBV病毒。乙肝病毒疫苗的应用在全世界范围内大大降低了乙型肝炎的发病率，但乙型肝炎仍是中国最常见的传染病之一，原因之一为HBV存在母婴垂直传播途径。现认为在增强或激活机体的天然免疫反应及特异性免疫应答过程中，人体的树突状细胞(DC)发挥着重要的功能[3]。树突状细胞是目前机体内最为强大的抗原提呈细胞，因其卓越的抗原提呈功能和免疫激活作用，在肿瘤和感染性疾病的研究中受到越来越多的关注。国内外大量的研究表明，慢性乙型肝炎者(无论成人还是儿童)外周血中DC都存在表型和功能的缺陷[4-5]，而慢性乙型肝炎感染产妇胎儿脐血树突状细胞的成熟和功能均低于健康胎儿脐血中树突状细胞[6]。对于孕妇感染乙肝病毒后胎儿脐血中DC亚群变化与HBV DNA载量的关系鲜见报道。本课题研究慢性乙型肝炎病毒感染产妇胎儿脐血树突状细胞亚群的变化与HBV DNA的关系，为降低慢性乙型肝炎母婴传播提供有益准备，并为将来早期阻断儿童慢性乙型肝炎病毒的感染提供理论基础。
对象与方法
一、对象
采集哈尔滨医科大学附属第一、第二医院2008年11月—2009年5月收治的28例慢性乙型肝炎病毒感染产妇及12名健康产妇的新生儿脐血标本。产前酶联免疫吸附实验(ELISA)检测HBV血清学标志，大三阳(HBsAg, HBeAg,抗-HBc阳性)、小三阳(HBsAg,抗-HBe,抗-HBc阳性)分别为82.1%(23/28)和17.9%(5/28)，诊断均符合2000年病毒性肝炎防治方案[7]。产妇年龄22～30岁，平均(29.0±1.0)岁；HBV感染病史平均(11.0±2.0)年，近1年未接受过抗病毒及免疫治疗。产妇均无心、脑、肾疾病及其它慢性疾病、合并症。
二、方法
1.主要仪器和试剂：FACS Calibur流式细胞仪，FACS溶血素(临用前用去离子水稀释1:10)，免疫荧光三标记树突状细胞检测试剂盒，内包含FITC标记鼠抗人单克隆抗体(BD biosciences catalog No.340546)，PE标记鼠抗人单克隆抗体(BD biosciences catalog No.340545、347367、349043、349053)，PerCP标记鼠抗人单克隆抗体(BD biosciences catalog No.347364)，以上均购自美国BD公司。离心机，PBS缓冲液，1%多聚甲醛。Light Cycler荧光定量PCR检测仪(美国Roche公司)，HBV核酸扩增荧光定量检测试剂盒(深圳匹基生物工程有限公司)。
2.DC亚群检测：每份标本设标有管1、管2、管3、管4的4个试管，分别加入PE标记的CD123、CD11c、鼠IgG1和鼠IgG2a单克隆抗体各5 μl，然后向每支试管中分别加入FITC标记的Lineage1 10 μl和PerCP标记的抗HLA-DR 10μl,再向每支试管中加入新鲜脐血100μl,充分混匀，室温避光孵育15 min后，向每支试管中加入FACS溶血素2 ml,室温避光孵育15 min，离心，弃上清。然后向每支试管中加入PBS缓冲液1 ml，洗涤2次，再离心弃上清。最后将细胞置于1%多聚甲醛溶液0.5 ml中，2～8℃避光固定，24 h内上流式细胞仪进行检测。先设R1圈出外周血淋巴细胞群，然后再设R2圈出Linl(CD3、CD14、CD16、CD19、CD56)阴性或弱阳性的细胞群，分别排除淋巴细胞、单核细胞、NK细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞，再在R1、R2的基础上设R3圈出Linl-、抗HLA-DR+、CD123+的细胞即为DC2细胞亚群，而Lin1-、抗HLA-DR+、CD11c+的即为DC1细胞亚群。
3.HBV DNA的定量测定：采用实时荧光定量PCR法检测，用Light Cycler荧光定量PCR检测仪，检测灵敏度为103拷贝/ml。
4.数据处理：应用FACSQuest软件包处理数据，在流式细胞分析中，需获取50 000个细胞，FACS设阈值。分析HLA-DR/Lin1点图中的HLA-DR阳性、Lin1弱阳性和阴性的细胞群体，以CD11c和CD123荧光抗体染色阳性细胞百分率记录结果。其中Lin1-HLA-DR+CD11c+细胞为DC1,Lin1-HLA-DR+CD123+细胞为DC2。
5.统计学处理：应用SPSS13.0软件进行统计学处理，计量资料以均数±标准差表示，采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
慢性HBV感染产妇和健康产妇新生儿脐血DC1、DC2和DC1/DC2比较，差异无均统计学意义。
慢性HBV感染产妇新生儿脐血HBV DNA阴性(HBVDNA<103拷贝/ml)、阳性(HBVDNA≥103拷贝/ml)分别为57.1%(16/28)和42.9%(12/28)；HBV DNA≥106拷贝/ml、HBV DNA<106拷贝/ml分别为41.7%(5/12)和58.3%(7/12)。脐血HBV DNA阳性的DC1、DC2低于HBV DNA阴性者，脐血HBV DNA阳性中HBV DNA>106拷贝/ml者的DC1和DC2相对数均明显低于HBV DNA<106拷贝/ml者，差异均有统计学意义；新生儿脐血HBV DNA阳性和阴性的DC1/DC2无变化，见表1。
表1新生儿脐血中DC亚群的比较
注：与脐血HBV DNA阴性相比，*P<0.05；与HBV DNA≥106拷贝/ml比较，#P<0.05
讨 论
慢性乙型肝炎是严重威胁人类健康的一种慢性疾病，目前人群中大约有15﹪左右是慢性乙型肝炎携带者或慢性乙型肝炎患者，大部分会发展成肝硬化甚至肝癌。母婴垂直传播是人类感染慢性乙型肝炎最主要的因素。树突状细胞(DC)是机体内功能最为强大的抗原呈递细胞，在机体免疫系统中处于核心地位，能显著刺激初始T细胞的活化和增殖，强烈地促进Th细胞和CTL生成，在启动抗原特异性细胞免疫反应中起到举足轻重的作用，其功能缺陷将导致抗原无法被有效地提呈给CD4+辅助性T淋巴细胞，从而产生异常的细胞免疫和体液免疫应答。人体内DC数量较少，主要存在于皮肤、肝脏、脾、骨髓、淋巴器官和外周血中，以骨髓、淋巴器官和脾脏含量较多。根据树突状细胞的起源不同可将DC分为二个亚群，即髓系树突状细胞(DC1)和淋巴系树突状细胞(DC2)，DC1主要诱导Th1免疫应答，促进细胞免疫的发生；DC2主要诱导Th2免疫应答，促进体液免疫的发生。近年来，DC与慢性乙型肝炎的关系日益受到人们的关注。大量研究发现，慢性乙型肝炎病毒感染者的DC功能低下，以DC1亚群为主，认为慢性乙型肝炎感染者DC1有表型和功能的缺陷，并与HBV感染后机体免疫耐受有关。近期有研究显示，慢性乙型肝炎患者外周血DC2数量和功能较正常人均明显下降，并发现慢性乙型肝炎患儿DC1和DC2百分比及绝对数均低于健康儿，说明慢性乙型肝炎患儿体内存在DC亚群数量和功能的缺陷，难以有效激活免疫反应，清除乙肝病毒[5]。Kunitani等[8]却发现，慢性乙肝病毒相关的慢性肝炎和肝硬变患者外周血DC1和DC2水平均下降。对于脐血中DC比例的报道少见。本研究发现，慢性乙型肝炎病毒感染产妇新生儿脐血中DC1、DC2亚群相对数均略高于健康产妇新生儿脐血；但DC1/DC无差异。HBV易感性与某些基因型有关[9]，本研究选择的标本大部分都来自慢性乙型肝炎大三阳产妇所生新生儿，部分新生儿由于自身基因型的特殊性可能并未发生宫内感染。本实验发现，新生儿脐血中HBV DNA阳性占42.9%，即新生儿并未全部感染乙肝病毒，考虑可能与HBV DNA复制程度及胎儿自身的免疫状态有关。有文献报道，HBsAg阳性孕妇所生新生儿脐血HBsAg阳性率为10%～15%[10]，而母血清HBV DNA含量≥106拷贝/ml时，胎盘感染乙肝病毒的危险性显著增加，同时脐血HBV DNA阳性率也明显增加。
乙肝病毒宫内感染是妊娠期间乙肝病毒从母体进入胎儿肝细胞内，新生儿出生时肝细胞内发现乙肝病毒可明确诊断。临床中检测胎儿肝组织和外周血存在困难，因而将检测新生儿脐血中HBV复制标志物作为研究HBV宫内感染的手段。HBV DNA是目前反映乙肝病毒复制及传染程度最直接、最敏感的指标。HBeAg是病毒复制的产物，它和HBV DNA一样均是反映HBV复制、传染程度的指标之一。脐血HBV DNA对于诊断胎儿感染，预测新生儿预后及乙肝病毒疫苗免疫失败，比HBsAg更有特异性和临床意义[11]。既往对成人慢性乙型肝炎外周血HBV DNA水平与树突状细胞的关系的研究表明，慢性乙肝者体内存在树突状细胞数量减少、成熟障碍,且这种改变与血清HBV DNA的水平呈负相关，HBV复制水平低者的树突状细胞绝对数量和CD83、CD86的表达水平明显高于HBV复制水平高者[12]。HBV DNA阳性者外周血DC2相对百分率低于健康对照[13]。本研究将新生儿脐血按照血清中的HBV DNA含量分类比较发现，新生儿脐血中HBV DNA阳性者DC1、DC2相对数均低于脐HBV DNA阴性者；HBV DNA>106拷贝/ml者的DC1、DC2相对数均明显低于HBV DNA<106拷贝/ml者。这一点与成人慢性乙型肝炎者外周血树突状细胞亚群变化相似，考虑可能为当脐血中HBV DNA含量大于103拷贝/ml时，新生儿已经存在乙肝病毒的宫内感染，而HBV可在DC内进行复制，进而感染DC而使其数量减少，导致脐血中树突状细胞亚群数量和功能缺陷，难以激活免疫反应，清除乙肝病毒，也可能是新生儿及儿童患慢性乙型肝炎及成为乙肝病毒携带者的重要原因，具体机制尚需进一步研究。这部分新生儿将来患或携带慢性乙型肝炎的几率会更高，因经济原因及采集标本存在困难，且实验时间较短，样本量较少，目前不能做出肯定结论。
参考文献
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