常染色体显性遗传性多囊肾病的产前基因诊断技术

常染色体显性遗传性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)是一种常见的遗传性肾病，发病率约1/400～1/1000，有明显的家族发病特征。ADPKD是一种涉及多系统、多脏器的全身性疾病，主要表现为肾脏多个液性囊肿进行性增大而导致肾脏结构和功能不同程度的损害，还引起肝、胰、脾囊肿、颅内动脉瘤、心脏瓣膜异常、高血压等肾外疾病[1-2]。近半数ADPKD患者在60岁左右发展成终末期肾功能衰竭，需要通过反复透析治疗或肾脏移植来维持生命，目前尚无有效治疗方法。ADPKD属延迟显性遗传，患者平均发病年龄为40岁，此时多已将致病基因传给下一代。因此及时对ADPKD家系中高风险胎儿或胚胎进行产前诊断，隔断基因的遗传，是控制该病发生和发展的关键。

目前已知引起ADPKD的3种基因有PKD1、PKD2和PKD3。其中PKD1是最常见的致病基因，约80%～85%的患者是由PKD1基因突变引起的，约10%～15%的患者是由PKD2基因突变引起的，PKD3仅有散见的病例报道[3]。PKD1与PKD2突变引发的ADPKD相比，PKD1的临床症状比较严重且发病年龄相对早。仅依靠临床证据难以鉴别，只有通过分子生物学的方法才能真正区分。PKD1基因定位于染色体16p13.3，基因长度为47 kb，含有46个外显子，转录的mRNA约14.1 kb，编码的蛋白质产物称为多囊蛋白1，介导细胞- 细胞间相互作用。PKD2基因定位于染色体4q21-23，基因长度为70 kb，含有15 个外显子，转录的mRNA 约为5.1 kb，编码的蛋白质产物称为多囊蛋白2，是一种通道蛋白[4-5]。PKD3发病率极低，所获家系有限，目前尚未定位克隆[6]。

ADPKD为常染色体显性遗传，外显率为95%。若能存活到80岁，外显率达100%；具有较高的遗传率，父母亲中的一方患病，其子女的发病风险为50%。临床上ADPKD的诊断思路：(1)详细询问病史，ADPKD为系统性疾病，累及肾脏、肝脏、肺脏、脾脏等，常表现为腰腹部疼痛、血尿、肾功能不全、高血压、肝囊肿、结肠憩室等；重点了解家族遗传病史，确认家族中有无同类病人，家族遗传史是否符合常染色体显性遗传特征；(2)影像学检查，判断患者肾脏是否存在液性囊肿。肾脏B超检查的诊断标准：15～39岁的患者单侧或双侧肾脏至少存在3个囊肿；40～59岁的患者每个肾脏均至少存在2个囊肿；在60岁以后每个肾脏至少有4个囊肿[7]。CT检查较B超敏感，可以发现更小的囊肿。(3)基因分析：对于影像学检查模棱两可的患者，基因分析是较好的诊断方法。影像学诊断ADPKD的假阴性率与年龄有关，年龄越大，假阴性率越高。基因分析使ADPKD症状前诊断成为可能，检测ADPKD家系患者，提供遗传学咨询和随访。连锁分析适用于家系成员明确诊断，标记基因与ADPKD基因距离小。而关于孕妇的产前诊断：(1)对于明确有ADPKD家族史的孕妇，要诊断胎儿是否携带致病基因，则要根据孕周大小选择具体的检查方法：早孕期(9～14周)一般采取绒毛穿刺术检测胎儿基因，此时B超检查未能显示胎儿肾脏结构；中晚孕期优先选择胎儿B超检查肾脏结构，阴性者可以通过羊水穿刺术或脐带血穿刺术提取胎儿基因进行确诊；(2)对于无阳性家族史的孕妇，B是其首选的检查方法。如果B超显示胎儿多囊肾结构的孕妇，则可以进一步提取胎儿基因利用基因分析找出突变的基因。因此，基因诊断在早期产前诊断，及时终止妊娠上有明显优势。早在20世纪50年代，连锁分析就被应用于ADPKD基因诊断，称为间接诊断技术。PKD2测序完成以后，直接基因诊断得到较快的进展。本文回顾国内外有关ADPKD基因诊断的文献，对此作一综述。

一、连锁分析—间接基因诊断

限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism， RFLP)是最早用来绘制遗传图的遗传标记，也被称为第一代遗传标记。它是指利用限制性内切酶将等位基因DNA切成不同长度片段，这些不同的DNA片段在人群中呈现多态现象，以孟德尔方式遗传。RFLP分析将PCR技术和电泳方法联合一起应用，先将待测的靶DNA片段进行复制扩增，然后应用DNA限制性内切酶对扩增产物进行酶切，最后经电泳分析靶DNA片段是否被切割而分型。凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变(新产生和去除酶切位点)和一段DNA的重新组织(如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化)等均可导致RFLP的产生。1985年，Reeders首次将RFLP用于ADPKD的基因连锁分析，利用a-珠蛋白基因的3′HVR 探针方法顺利将PKD1基因定位于16p13，成功地在世界上首次对一个ADPKD孕妇的胎儿进行了产前基因诊断[8]。RFLP分析方法使工作量得以减少，只要选取与致病基因连锁紧密的标记基因和适当的限制性内切酶，检出与致病基因连锁的片段，来判断受检者是否携带致病基因。但是，RFLP多态信息含量(polymophism information content，PIC)低，PIC平均只有0.3。多态性水平几乎完全依赖于限制性内切酶的种类和数量，使该项诊断技术的广泛应用受到了限制。随着杂合性更高的STR遗传标记的应用，RFLP逐渐被STR替代。

2.短串联重复序列(short tandem repeats，STR)随着第2代遗传图的绘制，开始了以STR为遗传标志的连锁分析时代。STR是一类广泛存在于人类基因组中的DNA多态性基因座，是以2～7个碱基为核心单位串联重复而成的一类序列，又称为微卫星DNA(microsatellite DNA)。由于核心序列重复数目的变化而在群体中呈现出遗传多态性，但在同一家系内具有高度的遗传保守性，以孟德尔方式遗传。利用微卫星DNA 进行多态性连锁分析，可在同一家系中筛选出ADPKD患者，它是目前临床上应用最多的一种ADPKD基因诊断方法[9]。用于ADPKD连锁分析的STR 基本为(CA)n重复，与PKD1连锁的微卫星DNA有SM7，SM6，AC2.5，SM5B，KG8，CW2和CW4等，与PKD2连锁的微卫星DNA有D4S414，D4S423，D4S1542和D4S1563等。微卫星DNA具有高度多态，PIC平均为0.7，其基因片段短、扩增效率高、判型准确等特点使得该技术在ADPKD的疾病诊断简便、快速、灵敏。选取多个与致病基因连锁的微卫星DNA作为标记可提高确诊率[10]。然而，该方法必须建立在对一整套家系样本全部分析基础上，而且目前所运用的微卫星DNA与致病基因间仍存在一定的重组可能性，对来自不同地区的家系其微卫星DNA的等位基因频率存在着明显的差异，因此运用微卫星DNA 作为ADPKD 的早期诊断技术时应值得注意。

3.单个核苷酸多态性检测(single nucleotide polymorphism，SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，它是人类可遗传的变异中最常见的一种，并作为第3代遗传标志。在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入。其实SNP在基因组内特定核苷酸位置上只存在两种不同的碱基， 即转换和颠换，但其中最少的一种在群体中的频率不小于1%。单核苷酸多态性的数量在人类基因组中非常庞大，约占人类DNA多态性的90%[11]，可用于ADPKD的连锁分析。SNP与RFLP和STR等DNA标记的主要不同在于:它不再以“长度”的差异作为检测手段，而是直接以序列的差异作为标记。但SNP单个基因座的多态性很差， 只有二态，为此采用多个SNP基因座进行“单倍型”分析尤显重要。 SNP分析具有以下特点,(1)SNP 密集高，平均每1 000 bp就有1 个SNP，在整个基因组的分布达3×106个，遗传距离为2～3 cm，密度比STR更高，可以在任何一个待研究的基因内部或附近提供一系列标记；(2)与第1、2代遗传标记相比，SNP有更高的遗传稳健性，不会产生假带；(3)由于SNP是二态的，易于自动化批量检测，易于计算机分析结果。在进行PKD基因突变分析的测序中， 检测到位于基因编码区和非编码区的数个SNP[12]。SNP能充分反映个体间的遗传差异，可能有助于理解ADPKD患者的表型多样化。SNP的研究已受到广泛的重视，也是人类基因组计划中的一个重要补充和研究热点。

二、直接基因诊断

1.直接序列测定(direct sequencing)是对PKD1和PKD2基因的PCR扩增产物直接进行序列测定，而不需要先克隆到测序载体上，能确定突变基因的位置和性质，是所有检测方法中最为精确的直接检测方法。但由于PKD1和PKD2基因较为复杂，涉及突变的位点较多，而且每个位点致病基因较长，对其直接测序难度较大，耗时繁琐，短时间内无法在临床上大规模开展。

2.变性梯度凝胶电泳(denaturant gradient gel electrophoresis，DGGE)可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变需要。正常基因和致病基因根据其DNA片段的熔解性质，电泳移动速度的差异就可检测出双链中是否存在碱基突变。设计PKD1和PKD2基因特定片段两侧最佳的PCR引物和变性条件，进行PCR扩增后将其产物在含尿素和甲酰胺浓度递增的变性胶上电泳，如果出现不同的条带，说明存在碱基突变[13]。通过ADPKD患者致病基因条带的分析，来判断受检者是否携带致病基因。DGGE方法几乎可以检验出所有突变，在DNA片段长度600 bp以内的单碱基检出率可达95%，且条件改进后操作方便。但是 DGGE只能检测突变的存在而无法确定突变在DNA片段中位置，且样本引物和条件复杂，需要专门的设备和用含有毒性物质甲酰胺的梯度凝胶。

3.单链构象多态性分析(single-stranded conformational polymorphism，SSCP)是一种DNA单链凝胶电泳技术，结合PCR技术进行基因检测。它可根据不同构象的DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳时，由于组成碱基不同而形成不同的DNA单链构象，导致迁移率的变化来检测基因变异。用于SSCP分析的核酸片段越小，检测的敏感性越高。对于<200 bp的片段，SSCP可发现其中70%的变异；对于300 bP左右的片段则只能发现其中50%的变异；SSCP可以灵敏地分析150～200 bp DNA上的点突变。对于大于400 bp的PCR产物就需要设法进一步处理，可以用限制性酶消化PCR产物，产生小于400 bP的DNA片段，再进行SSCP分析。因此Z在ADPKD基因诊断中如何选择大小合适的DNA片段进行PCR扩增是提高SSCP敏感性的关键[14]。SSCP技术的优点是成本低、简便快捷，不受家系连锁分析的限制，能够对单个患者进行突变的检测，且对单个位点的变异检出率较高；缺点是不能判定突变的位置和性质，且由于PKD 致病基因的异质性和突变位点的不固定性，还有5%～30%的漏诊率[15]。

4.变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography，DHPLC)是一项在单链构象多态性(SSCP)和变性梯度凝胶电泳 (DGGE)基础上发展起来的新的杂合双链突变检测技术，可自动检测单碱基替代及小片段核苷酸的插入或缺失。该技术最早被运用于分析人Y染色体单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphism，SNP)以进行人种进化的遗传性研究[16]。DHPLC敏感性和特异性可达96%～100%，明显高于常用的DGGE、SSCP等变异检测技术。除此之外，DHPLC能够进行高通量检测、自动化程度高、检测DNA片段和长度变动范围广、检测周期短且相对价廉。因此，DHPLC尤其适合于基因结构复杂而无突变热点或突变频率低于20%的单基因变异，以及多基因致病突变[17-18]。

5.基因芯片(gene chip)是一种重要的高通量基因组研究技术，它是将大量的靶基因全长或片段有序地、高密度地(点与点之间的距离一般小于500 nm)排列在玻璃、硅等载体上，也叫基因微矩阵(gene microarray)。基因芯片的原理是碱基配对。样品通过一条或多条已知序列经过标记的核酸探针进行杂交，通过检测杂交结果而测定样品序列。其中基因表达谱(gene expression profile)能够快速、高效、多参量同时研究大量基因在不同组织、细胞、发育阶段中的差异表达，真正实现了基因分析的大规模、平行、小型和自动化。优点是可以一次分析大量样品，缺点是容易出现假阳性。利用基因芯片技术筛查多囊肾组织基因差异有一定的准确性[19]。然而，在筛选差异表达基因时，可能会出现假阳性和假阴性结果。但这是初步结果，对实验结果应进行RT-PCR，Southern blotting或Western blotting验证[20]。

6.多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行定性和定量分析的新技术，它利用简单的杂合(hydriation)、连接(ligation)及PCR扩增(PCR amplication)反应，于单一反应管內可同时检测40个不同的核苷酸序列的拷贝数变化，能够区分只有1个核苷酸不同的序列[21]，是检测遗传性疾病基因缺失和重复突变的有效方法，已逐渐成为外显子缺失与扩增检测中的主要技术手段。MLPA可以检测从单个碱基缺失到整条染色体的数量变化的各个水平的基因拷贝数变异，它采用先探针杂交，再用通用引物扩增的方式，能反映探针连接位点及周边序列的突变及多态性。MLPA PKD1/PKD2试剂盒里探针数量较多，可较为全面地检测PKD1/PKD2基因的外显子，且另外带有质量控制探针，确保了结果的可靠性[22]。在ADPKD的基因诊断中，MLPA具有一定的优势，其实验操作相对简单、设备要求低，只需两次反应便可检测所有的位点。通过PCR检测与测序、RT-PCR检测进一步验证；MLPA同时也存在一些局限性，如MLPA对实验中的温度、离子浓度、样本质量要求较高，且MLPA只能检出探针杂交部位的突变等。

随着分子生物学技术的不断发展，越来越多的新技术与检测方法将应用于ADPKD基因分析，推动ADPKD的基因诊断在临床上的推广应用。ADPKD是一种危害性较大的遗传病，早期诊断、早期预防、早期治疗是控制和延缓该病发生发展的有效措施。对于有高危风险的胎儿(有阳性家族史，父母有生育过或发现过ADPKD的患儿即先症同胞者)，在其生育时行产前诊断，能有效地阻断突变基因传给下一代。产前诊断可以在孕期进行，早孕期(6～9周)可以通过绒毛检测，中孕期(16～22周)可以通过抽取羊水或(22～25周)脐带血，运用基因诊断的方法，对胎儿进行基因检测。对携带有致病基因的胎儿建议终止妊娠，这样有利于降低发病率，对于优生优育、提高我国人口质量重要意义。

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