四氢生物蝶呤缺乏症(tetrahydrobiopterin deficiency，BH4D)属于常染色体隐性遗传病，是一种特殊类型的苯丙酮尿症(phenylketonuria，PKU)，是由于苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)等芳香族氨基酸羟化酶辅助因子——四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，BH4)合成或代谢途径中某种f酶的先天性缺陷导致的一种芳香族氨基酸代谢障碍，可影响脑内神经递质合成，致使患儿出现严重的神经系统损害症状、体征和智能障碍[1]。现有研究表明，共有5种酶参与辅酶BH4的合成或代谢循环[2]，任何一种酶基因的缺陷均可导致BH4D，6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶(6-pyruvoyl tetrahydropterin synthase，PTPS)是BH4合成必需的催化酶，PTPS缺乏是导致BH4D的最主要原因[3]。目前为止，国际相关网站(http://www.biopku.org/biomdb/search-results.asp)已报道的PTPS基因突变共53种(图4)。研究表明，中国人80%以上的PTPS突变为N52S(c.155A>G)、P87S(c.259C>T)和D96N(c.286G>A)突变[4-6]。新疆地区开展BH4的诊断及鉴别诊断起步较晚，本文通过新生儿疾病筛查并诊断了新疆首例6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶缺乏症(PTPSD)患者，现就该例PTPSD的诊断过程、鉴别诊断标准及基因突变分析结果报道如下。
对象与方法
一、对象
患儿，男，为第1胎第1产，于2013年5月6日在本院产科剖宫产出生，胎龄38+3周，生后无窒息，出生体重3 000 g，身长50 cm，出生72 h(充分哺乳6次以上)采血经新生疾病疾病筛查测定血苯丙氨酸(Phe)为176.1 mmoL/L，召回复查。患儿出生20 d后测定血苯丙氨酸(Phe)为222.6 mmoL/L，确诊为高苯丙氨酸血症(HPA)，采集尿液、血斑等标本进一步行鉴别诊断。复查临床症状体征有表情及反应正常、头发正常、眉毛正常、口水多、皮肤稍白、四肢肌张力稍有降低，尿无特殊异味。
二、方法
1.尿蝶呤谱分析：采用Waters公司510型高效液相色谱仪(HPLC)，用反相层析法对所有血Phe增高(>120 μmol/L)者或伴有严重肌张力低下等神经系统损害表现者进行尿新蝶呤(neopterin，N)、生物蝶呤(biopterin，B)浓度测定，并计算B%=B/(N+B)×100%。
鉴别诊断标准包括，(1)N明显增加，B明显降低，N/B增高，B%<10%，甚至5%或测不出，考虑为PTPS缺乏；(2)N可正常或稍高，B明显增加，N/B降低，B%增高，有些患者尿蝶呤谱也可正常，需进一步做红细胞二氢生物蝶呤还原酶(dihydrobiopterin reductases, DHPR)活性测定，考虑为DHPR缺乏；(3)N、B均降低，N/B正常，考虑为鸟苷三磷酸环水解酶(guanosine triphosphate cyclohydrolase,GTPCH)缺乏；⑷如果N/B正常，BH4(+)，可考虑为经典型PKU。
2.BH4负荷试验：BH4负荷试验或Phe和BH4联合负荷试验是一种快速而可靠的辅助诊断试验。在血Phe浓度较高(>600 μmol/L)情况下，可直接给予口服BH4片(20 mg/kg)，BH4服前和服后2、4、6、8、24 h分别取血作Phe测定，此外，服前和服后4～8 h分别留尿做尿蝶呤分析。对于血Phe≤600 μmol/L者，可作Phe+BH4联合负荷试验，即给患儿先口服Phe(100 mg/kg)，服后3 h再口服BH4。于服Phe前和后1、2、3 h，服BH4后2、4、6、8、24 h分别采血测Phe浓度。
鉴别诊断标准包括(1)经典型PKU者因苯丙氨酸羟化酶(PAH)缺乏，血Phe浓度无明显变化；(2)BH4缺乏者，当给予BH4后，因其PAH活性恢复，血Phe明显下降；(3)PTPS缺乏者，血Phe浓度服用BH4后4～6 h可下降至正常；(4)DHPR缺乏者血Phe浓度在用BH4后8 h或以后可下降至正常，也有部分患者血Phe不能降至正常，需作DHPR活性测定予以助诊。
3.红细胞DHPR活性测定[7]：取外周血2滴于干滤纸上，血斑直径>5 mm，采用日本岛津UV-2450型双光束分光光度计进行检测，每次检测同时测定正常对照标本，以得出待测标本DHPR活性为正常对照活性的百分比(%)，DHPR缺乏者其酶活性极低或测不出。
4.PTPS基因突变分析：采集患儿及其父母外周静脉血分离白细胞，采用酚-氯仿法抽提DNA。首先对已报道的N52S、P87S和D96N 3种热点突变进行筛检，对无热点突变者，按常规方法扩增PTPS基因所有外显子及第1内含子进行突变检测，PTPS基因引物序列及扩增产物见表1。
表1PTPS基因引物序列及扩增产物
注：*为扩增部分第1内含子[8]；#为扩增部分第1～4外显子[5]；△为联合扩增部分第5、6外显子[9]
(1)热点突变的筛检。采用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析方法[5]。PTPS基因6个外显子及第1内含子的扩增引物见表1[5,8-9]。采用内切酶Tsp509 I对第2外显子的PCR产物E2进行酶切，以筛检N52S突变，携带该突变者因失去1个酶切位点而产生33 bp、111 bp和183 bp 3个片段。分别用BbvI和FokI对第5、6外显子的PCR产物E5进行酶切，以筛检P87S和D96N突变，携带这两个突变者分别失去BbvI和FokI酶切位点而仅有543 bp 1个片段。酶切产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染后扫描分析。(2)PCR-序列分析法。对PCR-RFLP法筛检发现上述热点突变者，进一步通过相应外显子测序予以证实；对不存在热点突变者，扩增PTS基因第1～6外显子及部分第1内含子，PCR产物由上海生工技术有限公司进行产物纯化，应用3700测序仪进行测序，寻找基因突变。(3)基因新突变的确定。对未报道的基因新变异通过患儿基因双向检测及父母基因检测证实，并对50名正常儿童进行相应基因突变检测以排除多态性。
结 果
一、尿蝶呤分析
患儿尿蝶呤测定结果显示，尿新蝶呤(N)和生物蝶呤(B)分别为2.95 mmol/molCr(新生儿参考值为1.2～2.92 mmol/molCr), 0.08 mmol/molCr(新生儿参考值为0.42～1.92 mmol/molCr)，B%为2.64%(新生儿参考值为19.8%～50.3%)，由于N有所增加，B明显降低，N/B增高，B%<5%，疑诊为PTPS缺乏性的BH4D。
二、Phe+BH4联合负荷试验
患儿基础血Phe浓度为271.2 μmol/L，Phe负荷3 h时血Phe上升至756.0 μmol/L，血Phe浓度在BH4负荷后2、4、6 h逐步下降，分别为488.4 μmol/L、303.6 μmol/L、283.2 μmol/L，提示血Phe对BH4负荷有反应，由于血Phe浓度服用BH4后6 h已逐步下降至基础血Phe浓度水平，考虑确诊PTPSD。
三、DHPR活性测定
DHPR活性测定结果为1.71 nmol/(min·5 mm disc)，正常参考值为1.02～3.35 nmol/(min·5 mm disc)，为正常对照者活性的45%，从而排除DHPR缺乏症。
四、基因突变分析结果
PCR-RFLP法筛检发现患儿第5外显子存在c.259C>T(P87S)错义突变(图1)，此突变使87位脯氨酸(Pro)变为丝氨酸(Ser)；通过扩增PTPS基因所有外显子及第1内含子并测序，发现患儿第1内含子存在剪接位点突变IVS1-129A>G，即在第1内含子有-129bp处发生碱基A→G转换(图2)，导致基因转录异常。同时对患儿父母进行突变测序，证实P87S杂合突变来自于母亲(图3)，IVS1-129A>G杂合突变来自于父亲(图2)，据此可认定患者携带两个PTPS突变，基因检测结果符合PTPSD临床诊断。
图1 患儿E5/BbvⅠ酶切产物
注：M2为DL2 000分子量标记；(-)为阴性对照；N为正常对照；CH为患儿
图2 突变IVS1-129A>G测序结果
图3 突变c.259C>T(P87S测序结果)
对50例正常儿童(100个等位基因)PTPS基因第1内含子进行测序，未发现存在IVS1-129A>G突变。经查阅国内外已发表专业文献及在BH4突变基因相关国际数据库( http://www.biopku.org/biomdb/search-results.asp)检索(图4、图5)，证实IVS1-129A>G为国际上尚未报道的新突变。
讨 论
BH4D是一种特殊类型的高苯丙氨酸血症(hyperphenylalaninemia, HPA)，又称“非经典型PKU”或“恶性PKU”，其发病率各国报道不一。在白种人中BH4D约占HPA的1～2%[10]，台湾约占19%，沙特阿拉伯约占66%[11]。中国南方地区BH4D占到HPA的12%～36.4%[4,12]，远高于中国北方的研究报道[13]。中国86%的BH4D是由于PTPS缺乏所致，PTPS缺乏导致BH4合成障碍，苯丙氨酸蓄积，多巴、肾上腺素、5-羟色氨酸等生理活性物质缺乏，神经细胞髓鞘蛋白合成下降，机体免疫功能下降等，即使早期对患者进行低苯丙氨酸饮食治疗，血苯丙氨酸浓度降低至正常，其神经系统损害仍进行性加重。目前国内大多数BH4D患儿出生时临床表现基本正常，只是单纯性的表现为Phe浓度升高，患儿都是在接受低苯丙氨酸奶粉等饮食治疗无效，出现了发育落后、惊厥、吞咽困难、肌张力异常等严重神经系统损害时，才进行BH4D的诊断及鉴别诊断，由于BH4D的治疗方法不同于PKU，加上其易被漏诊或误诊，为做到早期诊断、早期治疗，建立科学、规范的HPA诊断程序就显得极为重要。
图4 BH4D-6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶(PTPS)基因突变类型
图5 BH4D-6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶(PTPS)基因内含子1突变类型
(http://www.biopku.org/biomdb/search-results.asp)
本例患儿经新生儿疾病筛查检出其Phe浓度偏高，第1次召回复查就采集患儿及其父母的血样、尿液，如复查Phe浓度仍旧偏高，首先确诊患儿为HPA；第2阶段就立即对患儿标本进行红细胞二氢蝶呤还原酶活性测定、尿蝶呤谱分析、BH4负荷试验或Phe和BH4联合负荷试验，目的为进行HPA鉴别诊断并进行病因分析，形成临床诊断及分型；第3阶段对患者及其父母进行基因突变分析予以确证。本研究对BH4D患者的诊断策略进行优化，基于目前本区新筛工作实际出发，大多数新筛采血机构与各新筛检测实验室距离偏远，血液、尿液等标本采集困难、标本递送周期较长，召回复查成本过高等因素，这些都极易导致BH4D患者诊断周期比较长，容易贻误患儿最佳治疗时机。因此，将PAH、PTPS、DHPR等基因突变分析纳入HPA的诊断及鉴别诊断程序，可为患儿进行快速早期的诊断，提供更直接的确诊依据，以期能尽早对其实施有效的治疗，避免严重的神经系统损害及智能障碍的发生。
Thony等[14]于1992年克隆了人PTPS基因，将其定位于人第11号染色体(11q22.3)，全长约9 kb，共有6个外显子，编码145个氨基酸本研究发现患儿的PTPS基因存在c.259C>T(P87S)和IVS1-129A>G 2种突变，分别位于第5外显和第1内含子。顾梅青等[15]研究表明，对PTPS基因第5、2外显子和第1内含子进行4中热点突变检测，可大大提高基因诊断效率，降低成本，这与本研究结果较为一致。现有研究已表明，P87S为PTPS基因常见的错义突变类型，其可导致严重型PTPSD的临床表型[16]。IVS1-129A>G是本研究在世界范围首次发现的新突变类型，是由于第1内含子-129bp处发生碱基A→G转换，推测内含子剪接位点突变可能会导致mRNA保留一段内含子序列，由于氨基酸序列错位，导致翻译生成的肽链不能合成完整的PTPS而造成酶功能缺陷或丧失，根据患儿的临床症状和体征，初步评估IVS1-129A>G可能导致外周型PTPSD，这需要通过反转录聚合酶链式反应分析IVS1-291A>G改变对RNA剪接的影响和体外表达研究来予以进一步证实。
PTPSD是BH4D的主要病因，PTPS基因诊断是患儿诊断的必要有效手段，通过建立科学、严谨、规范的BH4D诊断及鉴别诊断程序，针对特点突变进行快速筛查，可使PTPSD患儿获得早期诊断和正确治疗，避免出现严重的神经系统损害，同时为患儿家庭的产前诊断和遗传咨询提供有力的实验数据支持。
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