玉米是许多国家的主食[1]，也是动物饲料的重要来源，并有许多工业用途，例如生产黏合剂、燃料和甜味剂[2]，也作为许多基本生物进程研究的示范品种。20世纪80年代开始，转基因技术得到了迅速发展，1990年第一株转基因玉米问世。转基因玉米的主要优势为农艺性状，如杂草控制和抗病虫害[3]。1996年转基因作物进行商业化种植[4]，转基因玉米迅速在全球范围内商业化[5]。2011年，全球转基因作物种植面积达到1.6亿公顷，其中5100万公顷用于种植转基因玉米，占32%[6]。转基因作物已普及，但并非无争议，主要批评专注于转基因作物的环境和健康安全[7]。主要健康问题包括新的蛋白质产物的变应原性和毒性[7]。本研究通过连续两代试验评价转基因玉米Bt-799对Wistar大鼠仔代体格发育、生理发育和神经反射发育的影响。
材料与方法
一、实验动物和实验条件
1.实验动物：健康断乳SPF级Wistar大鼠300只，雌雄各半，由北京大学医学部实验动物科学部提供[实验动物生产许可证号为SCXK(京)2011-0012；实验动物合格证号为SCXK11-00-0004]。
2.实验条件：SPF级动物室，温度范围为(22.0±2.0) ℃，相对湿度为50%～60%，昼：夜明暗交替时间为12 h:12 h[实验动物使用许可证为SYXK(京)2012-0011；动物实验环境设施(SPF)合格证书为医动字第01-2055]。
二、方法
1.转基因玉米及非转基因玉米：转基因玉米是Bt-799抗虫转基因玉米。苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布非常广泛的革兰氏阳性菌，属于原核生物细菌纲芽孢杆菌科芽孢杆菌属。芽孢形成过程中，Bt菌体的一端或两端会形成一个或多个具有生物活性的蛋白质晶体。这种蛋白质晶体由cry和cyt编码，能在一些昆虫体内活化成有毒性的蛋白，并与昆虫中肠上皮细胞的特异性受体结合，使其产生穿孔，从而杀灭昆虫[8]。Bt-799抗虫转基因玉米就是通过研究Bt菌cry和cyt的特性，并将Bt杀虫蛋白基因导入玉米郑58的基因组中，获得的抗虫转基因玉米。
非转基因玉米是有传统食用史、被证实可安全食用、与转基因玉米Bt-799同品系的亲本玉米郑58。
转基因玉米Bt-799及其亲本郑58均由中国疾病预防控制中心营养所提供，种植于中国农业大学转基因玉米试验田，转基因玉米与非转基因玉米种植条件完全相同。
2.饲料配方：(1)AIN-93G对照组饲料。AIN-93G (American Institute of Nutrition-1993 Growth)配方由美国营养学会提供。该配方提供了满足啮齿类动物生长发育所必需的营养成分及含量，是公认的权威配方。(2)转基因玉米组饲料。以AIN-93G配方作为参照，根据转基因玉米Bt-799营养成分分析结果(表1)，加入不同剂量的转基因玉米，蛋白质不足的部分由酪蛋白补齐，其它营养成分根据AIN-93G配方补齐。转基因玉米最大加入量为84.68%。(3)非转基因玉米组饲料。饲料配制原则与方法同转基因玉米组。非转基因玉米最大加入量为84.68%。
表1玉米营养成分分析结果
注：*由农业部饲料效价与安全监督检验测试中心(北京)检测
3.剂量分组：根据性别、体重将300只Wistar大鼠随机分成5组，即AIN-93G对照组(BC组)、转基因玉米高剂量组(TH组)、转基因玉米中剂量组(TM组)、转基因玉米低剂量组(TL组)和普通玉米对照组(N组)，分别以AIN-93G配方、转基因玉米最大加入量配方(84.68%)、转基因玉米28.23%加入量配方、转基因玉米9.41%加入量配方和非转基因玉米最大加入量配方(84.68%)喂养(表2、3)。饲料由北京博泰宏达生物技术有限公司制作。
表2大鼠饲料组成(g/100 g)
4.实验设计：AIN-93G配方饲料适应1周后进行干预。干预到12周龄时进行交配。根据目前的报道[9-10]，雌雄2:1合笼隔夜交配。交配期为2周。交配期内，每天早上做雌鼠阴道涂片，检查到精子或发现阴栓认为受孕，定为孕0天，进行单笼饲养。孕鼠成功分娩后，每窝仔鼠于出生后第4天调整至相同数量(每窝12只)，雌雄数量相等。仔鼠于出生后第28天断乳，断乳后每组随机选取雌雄各30只，作为F1。TH组再随机选取雌雄各30只，以AIN-93G配方喂养，作为隔代TH组(GTH组)。F1繁殖产生F2，仔鼠调整至每窝8只(4雌4雄)，于出生后第21天断乳。本次试验获得北京大学医学伦理委员会批准。
5.实验内容：(1)仔鼠体格发育观察，记录F1、F2出生后第0、4、7、14、21、28天体重。(2)仔鼠生理发育指标检测，包括F1、F2耳廓分离、门齿萌出、睁眼、雄性睾丸下降和雌性阴道开放时间，将全窝仔鼠全部完成某生理发育指标的时间确定为该指标达标时间。(3)仔鼠神经反射发育指标检测，包括F1、F2平面翻正反射、悬崖逃避反射、负向地性反射和空中翻正反射形成时间，将全窝仔鼠全部完成某神经反射发育指标的时间确定为该指标达标时间。
6.统计学处理：使用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料采用
表示，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)和t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
表3大鼠饲料营养成分组成
结 果
一、仔鼠体格发育情况
F1仔鼠出生后体重稳步增长，不同时间点各组体重差异无统计学意义(图1)；F2仔鼠出生后随着日龄增加体重逐渐增加，且0～7、～14、～21、～28 d增长速度逐渐加快。TH组4、7、14 d仔鼠体重高于BC组，N组7、14、21 d仔鼠体重高于BC组，差异均有统计学意义；TH组与N组比较，差异无统计学意义；TL组28 d仔鼠体重较BC组和N组低，差异有统计学意义，见表4。
图1F1仔鼠体重情况
表4F2仔鼠体重情况
注：与BC组比较，*P<0.05；与N组比较，#P<0.05
二、仔鼠生理发育指标完成情况
F1仔鼠耳廓分离、门齿萌出、睁眼、雄性睾丸下降和雌性阴道开放达标时间分别为(4.3±0.4)d、(6.0±0.8)d、(14.5±0.7)d、(20.9±1.4)d和(34.2±1.8)d。各组各指标达标时间差异无统计学意义。F2 N组门齿萌出达标时间比BC组提前；TH组、N组睁眼达标时间较BC组提前，差异有统计学意义；TH组与N组比较，差异无统计学意义，见表5。
表5F2仔鼠生理发育指标达标情况
注：与BC组比较，*P<0.05；与N组比较，#P<0.05
三、仔鼠神经反射发育指标完成情况
各组F1、F2仔鼠平面翻正反射、悬崖逃避反射、负向地性反射和空中翻正反射达标时间差异无统计学意义；F2仔鼠各指标达标时间较F1仔鼠提前，差异有统计学意义，见表6。
表6F1、F2仔鼠神经反射发育达标情况
讨 论
F2仔鼠出生后随着日龄增加体重增长速度逐渐加快，14 d后稳步加快，21 d后显著加快。其原因可能是14 d前后，仔鼠先后睁眼，可以独立进食；21 d时，仔鼠断乳，分笼饲养，在空间分配和食物供给上为仔鼠生长发育提供了有利条件。F2仔鼠转基因玉米组和非转基因玉米组部分生理发育指标达标时间较对照组提前，不能认为是转基因玉米的毒性迹象，因为转基因玉米组和非转基因玉米组无差异。F2仔鼠生理发育指标和神经反射发育指标达标时间较F1仔鼠提前，可能与每窝仔鼠数量有关。为保证动物数量，F1调窝时每窝调至12只(6雌6雄)，而F2调窝时每窝仅调至8只(4雌4雄)。达标时间是指全窝仔鼠全部完成发育指标的时间，达标时间不可避免地与每窝仔鼠数量产生关联。母鼠繁殖仔鼠数量基本能够保证4雌4雄，保证6雌6雄相对困难，需要窝间调整，而窝间调整对达标时间的影响不容忽视。虽然F1和F2每窝仔鼠数量不同，但是每一代各组每窝仔鼠数量相同，所以每窝仔鼠数量不会产生组间影响。
神经行为学的变化是一种早期和敏感的毒理学指标，可在引起后代组织结构产生不可逆的损害之前表现出行为功能的障碍[11-13]。本试验期间未观察到F1和F2仔鼠外观形态异常，对F1和F2仔鼠生理发育指标和神经反射发育指标进行检测后得出饲喂不同剂量转基因玉米对仔鼠生理发育和神经反射发育无影响。此结论与国内外相关研究结论相同。屈静等[14](2012)将断乳SD大鼠(F0)随机分为对照组和试验组，每组雌雄各20只，对照组饲喂含有33%普通玉米的全营养饲料，试验组饲喂含有33%转基因抗矮花叶病玉米的全营养饲料。对照组和试验组分别饲喂饲料60 d后，各组按雌、雄1:1交配。F1仔鼠断乳后雌雄分笼饲养，继续给予与亲本(F0)相同饲料，繁殖传至2代(F2)，饲喂受试饲料至出生后60 d。对照组与试验组F2仔鼠生理发育指标和神经反射发育指标无差异。Kilic等[9](2008)研究同样表明，三代喂养食物中添加20%转Bt基因玉米并未对F1、F2和F3大鼠的神经行为产生有害影响。
参考文献
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