近几年，隐睾呈现发病率增高的趋势，国家中长期发展规划已关注成年男性性功能低下。在英国，1950—1980年隐睾的发病率由2.7%升至4.1%；在丹麦，1950—1990年发病率由1.8%升到8.4%[1]。中国目前隐睾发生率，新生儿为3.4%～5.8%，早产儿约占9.2%～30%，l岁时约为0.66%。关于隐睾及睾丸功能低下的病因至今没有得到合理的解释。随着近几年工业、农业的发展，大量塑料制品的应用，越来越多的证据指向环境内分泌干扰物的影响[2]。环境内分泌干扰物(environmental endocrine disruptors,EEDs)是指对生物的繁殖、发育、行为及保持动态平衡的体内天然激素的合成、分泌、传输、结合和清除起干扰作用的外源物质。邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)是最常见的环境内分泌干扰物,曾被认为是无毒物质被广泛用于塑料工业,可提高塑料的可塑性和强度。玩具、医疗器械等经常用到的化学合成品及母乳中，均能检测到DEHP的存在[3]，其毒性正逐渐被认识。2010年，Swan等[4]发现塑化剂DEHP类似邻苯二甲酸二丁酯(DBP)一样起到抗雄激素的作用，从而影响到雄鼠的性分化过程。在性分化的关键时期暴露DEHP，会造成雄鼠乳头残留等雄性不全的表现[5]。20世纪中期，DES是一种广泛应用的外源性雌激素，用于防止流产和妊娠期并发症，但后来发现服用DES的孕妇其男性后代隐睾的发病率明显升高[6]。DEHP和DES短期暴露导致隐睾的机制至今未被解释清楚，之前的研究对象大都来自胎内仔鼠，对于生后仔鼠长远的性发育情况报道很少。因此，本研究拟通过在仔鼠性发育的关键时期(GND12-PND3)染毒孕鼠，观察生后30 d的SD仔代雄鼠的隐睾及睾酮合成情况，以期对DEHP致雄性大鼠生殖发育的长期影响进行初步探究。
对象与方法
一、实验动物
SPF级别体重230～250 g雌性大鼠48只，雄鼠96只，购买于上海西普尔-必凯实验动物有限公司。饲养于屏蔽环境动物实验室内，自然昼夜节律采光，室温稳定在25 ℃。
二、方法
1.动物分组及处理：购买的SPF大鼠在屏蔽环境动物实验室内适应性饲养1周后，雌雄大鼠按1∶2的比例合笼，次日8点将雌鼠逐一阴道涂片后，显微镜下观察，发现精子当日记为孕期0 d(GND0)。将怀孕母鼠取出，放单独一笼。将孕鼠按体重编号，参照随机数字表进行随机区组设计分为空白对照组、玉米油组、DEHP低剂量组、DEHP中剂量组、DEHP高剂量组、DES组，每组8只。玉米油组喂饲玉米油1 ml /d；DEHP低剂量组喂饲DEHP 100 mg/(kg·d)+玉米油1 ml/d；DEHP中剂量组喂饲DEHP 500 mg/(kg·d)+玉米油1 ml/d；DEHP高剂量组喂饲DEHP 750 mg/(kg·d)+玉米油1 ml/d；DES组喂饲DES 100 mg/(kg·d)+玉米油1 ml/d；空白对照组常规喂饲饲料，不给予其他处理。在母鼠孕期第12天至产后第3天(窗口期)开始按上述方案给予给母鼠灌胃。待F1子代鼠生后30 d，统计各组子代雄鼠数量及隐睾仔鼠数目。F1代雄鼠用10%水合氯醛(0.2 ml/100 g)腹腔麻醉后，用一次性压力真空管抽取1 ml腹主动脉血。解剖取出双侧睾丸，去除脂肪、结缔组织及被膜并将每个睾丸分1 mm×2 mm×1 mm左右大小，放于冷冻管中，并标明所属组别和隐睾标记后，放液氮中保存备用。
2.主要仪器及试剂：Applied Biosystems 7500实时荧光定量PCR仪，IMMULITE 2000分析仪，HM315R石蜡切片机，HPJ-A型烘片机，TPJ-A摊片机，RT-PCR逆转录试剂盒(购于Takara公司)，Trizol Reagent(购于Invitrogen公司)，引物由上海sangon公司合成，DEHP、玉米油、DES均购买于美国sigma公司，睾酮测定试剂盒购买于siemens公司。
3.观察指标及检测方法：(1)Real Time RT-PCR法测定睾酮合成关键酶Star、P450scc、3β-HSD的mRNA的表达量。取100 mg睾丸组织放匀浆器后，加1 ml Trizol，待组织完全碾磨后转入1.5 ml离心管中，提取各组仔鼠睾丸组织RNA。紫外分光光度计检测RNA吸收光度A260、A280在1.8～2.0，琼脂糖电泳示RNA完整性良好时，取1 μg总RNA，根据Takara试剂盒说明书进行逆转录。Real Time RT-PCR法采用Sybr green嵌合荧光法。循环参数为95 ℃ 3 min，(95℃ 15 s，60℃退火1 min)×40个循环，60 ℃采集荧光，GAPDH为内参，SDS软件自动算出ct值，2-Δct法计算相对表达量。引物序列见表1。(2)睾酮的测定。将采集的F1代雄鼠血进行10 000 rfp，4 ℃离心，分离出1 ml血清。参照IMMULITE 2000手册进行试验前的准备，设置，稀释，校正，然后化学放光发法测定睾酮。(3)光学显微镜下观察睾丸病理切片。分别取各组1 mm×2 mm×1 mm大小睾丸放4%甲醛中固定24 h，石蜡包埋。冰冻切片机在制作5 μm厚切片，经脱蜡、脱水后，苏木精-伊红(HE)染色，常规封片，用带有标尺的显微镜下观察睾丸组织形态。
表1目的基因引物序列
4.隐睾的定义：隐睾判断标准为雄鼠自然状态下至少一侧睾丸未降至阴囊内且麻醉后解剖发现隐睾侧睾丸位于腹股沟上方。
5.统计学处理：应用SAS 8.02软件进行分析。计量资料以
表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，多组间两两比较用SNK法。计数资料用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、各组仔鼠隐睾发生率比较
孕期母鼠在窗口期暴露于DEHP低、中、高剂量和DES均可引起生后30 d部分SD大鼠隐睾。随着DEHP剂量的升高，隐睾发生率增加。低剂量组与空白对照组比较，低剂量分别与中、高、DES组两两比较，差异均无统计学差异；中、高、DES剂量组隐睾发生率与空白对照组比较，差异均有统计学意义；见表2。
二、各组仔鼠血清睾酮浓度比较
DEHP低、中、高剂量组及DES组仔鼠血清睾酮的浓度均减少，DEHP低、中、高剂量组呈现剂量依赖性。DEHP中、高剂量组和DES组分别与空白对照组比较，睾酮浓度降低，差异有统计学意义；低剂量组睾酮浓度与空白对照组、玉米油组比较，中，高剂量及DES组之间两两比较，差异均无统计学意义；见表2。
三、各组仔鼠睾丸组织结构变化
空白对照组和玉米油组睾丸组织学显示，生精细胞规整，生精小管之间无Leydig细胞聚集；DEHP低剂量组睾丸组织学无特异变化；DEHP中、高剂量组可见Leydig细胞(间质细胞)增生，且聚集成团；DES组未见明显Leydig细胞聚集，但有生精细胞减少，松散稀疏；见图1。Leydig细胞是产生睾酮的主要部位，DEHP中、高剂量组Leydig细胞的聚集反而产生更少的睾酮，这或许是DEHP致睾丸间质细胞损伤的代偿反应。
图1 各组仔鼠睾丸组织病理切片(HE染色，×200倍) A为空白对照组；B为玉米油组；C为DEHP低剂量组；D为DEHP中剂量组；E为DEHP高剂量组；F为DES组；箭头为Leydig细胞；三角为生精细胞
四、各组仔鼠睾丸组织关键酶P450scc、Star和3β-HSD的mRNA表达量比较
1.DEHP低、中、高剂量组P450scc、3β-HSD mRNA表达量均减少，DEHP高剂量组P450scc和3β-HSD mRNA表达量与空白对照组比较，差异有统计学意义；DEHP低、中、高剂量组Star mRNA表达量均较空白对照组增多，差异均有统计学意义；DES组P450scc、Star和3β- HSD的mRNA表达量均减少，P450scc、3β-HSD mRNA表达量与空白对照组比较，差异有统计学意义，见表2。
讨 论
隐睾又称睾丸下降不全，指睾丸未能按正常发育过程从腰部腹膜后下降至阴囊底部，在儿科内分泌和泌尿外门诊中是一种常见疾病。隐睾的睾丸由于位置较高，不仅容易发生机械性损伤，而且长期处于腹腔较高温度的环境下，会造成睾丸生精功能的损害，导致男性成年后生育率下降甚至不育。DEHP作为一种最常见的环境内分泌干扰物广泛存在。DEHP和DES具有良好的脂溶性，可以穿透胎盘。因此，染毒孕期SD大鼠会对胚胎期SD大鼠造成影响。本研究选取生后30 d的F1代仔鼠作为研究对象的原因为，正常情况此时间点的睾丸应分别降至双侧阴囊内。
正常睾丸下降分为两个阶段，腹内阶段和腹股沟阶段。睾丸腹内阶段下降时主要是由睾丸间质细胞分泌的INSL3介导，腹股沟阶段是主要通过雄激素作用。当睾酮的生成减少时，就会影响到睾丸的下降，从而导致隐睾的发生。临床上80%的隐睾是睾丸停留在腹股沟阶段，所以雄激素对睾丸的下降起着重要作用。
表2各组F1仔鼠隐睾发生率，血清睾酮浓度，关键酶P450scc、Star和3β- HSD mRNA的表达水平
注：与空白对照组比较，*P<0.05
睾丸间质细胞是合成雄激素的主要部位，正常的间质细胞功能对睾酮的生成有决定性的作用。本研究发现，仅在胎鼠胚胎发育的关键窗口期短期染毒胚胎幼稚体，DEHP低剂量组睾丸间质细胞和支持细胞遭到的损害不明显，但随着剂量的增加，DEHP中剂量和高剂量组生后30 d的F1代雄鼠间质细胞的损害逐渐加重。值得注意的是，在整个实验过程中，子代鼠仅在胚胎期至生后3 d短暂接触到DEHP和DES。DEHP在动物体内并不积聚，3～4 d即可完全排除体外[7]。本研究表明生后30 d仍然可以观察到间质细胞受到明显的损害，提示DEHP和DES的短期孕期暴露就可对大鼠的间质细胞造成是持久性损害，而且会随着染毒剂量增加而加重。
雄激素是以胆固醇在胆固醇侧链裂解酶(P450scc)作用下生成的孕烯醇酮为前体，经过Δ5或Δ4途径合成的产物。人类雄激素的生成是进行Δ5途径，而大鼠和小鼠是Δ4途径。孕烯醇酮在3β-HSD酶的作用下生成孕酮，孕酮在17α-羟化酶作用下形成17α-羟孕酮，又经17，20碳链裂解酶作用形成雄烯二酮，再经17β-羟甾醇脱氢酶作用后形成睾酮。所以P450scc、3β-HSD酶是睾酮合成关键酶，此酶的缺乏将导致睾酮合成障碍。DEHP各剂量组和DES组中P450scc，和3β-HSD的mRNA表达量均减少，提示DEHP和DES可通过抑制SD大鼠睾酮生成过程中的关键酶P450scc和3β-HSD的基因表达造成睾酮的生成减少。
Star的主要作用是转运胆固醇到线粒体内膜中，是睾酮形成的限速酶。Star的表达受多种信号转导途径的影响，cAMP依赖的蛋白激酶A介导磷酸化、Ca2+和磷脂依赖的蛋白激酶C、钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶II等都影响到到Star的表达。DEHP各剂量组中Star mRNA表达量增加，说明DEHP暴露后胆固醇转运到线粒体内这个过程是增强的，这和Leydig细胞聚集是一致的，或许同样是DEHP致Leydig细胞损伤的代偿反应。DEHP的影响下，在线粒体外的Star的基因表达量增加，线粒体内的P450scc、3β-HSD的基因表达量减少，这是否说明DEHP在线粒体内外的作用机理不同，还需进一步探究。
Notch蛋白广泛存在于各种组织器官中，并且在调控细胞的分化增殖中发挥重要作用。大量的研究表明，Notch1基因的异常表达与肿瘤相关，但近来的研究发现该基因在生殖发育方面起着重要作用。2011年发现β-catenin及Notch1基因敲除的小鼠出现引带发育障碍，而引带在睾丸的下降过程中发挥着重要作用[8]。2013年刘东尧等[9]发现，孕期染毒DEHP 500 mg/(kg·d)的SD大鼠的生后20 d的子代雄鼠Notch1 mRNA和蛋白的表达量均较正常组低，并推测Nocth1基因的改变影响了生殖母细胞向精原干细胞的分化过程，会导致远期不育的发生。
本课题组已证实，DEHP中剂量组、DEHP高剂量组Notch1 mRNA的表达与玉米油组及正常对照组比较，DES组Notch1 mRNA 的表达与对照组比较，差异均有统计学意义，说明在大鼠胚胎晚期染毒DEHP出现睾丸下降不良，可能是由于DEHP抑制INSL3的表达，导致其下游的β-catenin及Notch1 mRNA和蛋白的转录表达减少，进一步导致引带分化、增殖不全，睾丸不能完全下降到阴囊内。但DEHP中剂量组INSL3 mRNA表达有明显降低时，β-catenin mRNA的表达仍无明显变化，说明可能还存在其他基因影响后者的表达。胎内短暂暴露DEHP和DES对子代鼠的影响是持久的，不仅会影响生后30 d大鼠睾酮的主要生成部位Leydig细胞的形态学，而且会造成睾酮生成过程中关键酶P450scc和3β-HSD基因表达的减少，致睾酮的生成减少，直接影响到睾丸停留在腹股沟阶段。值得注意的是，F1代大鼠无论出生前还是出生后均未直接接触到DEHP和DES，仅在围产期接触一定剂量的环境内分泌干扰物就会对其生殖发育造成持久的影响。这为临床诊治隐睾过程中提供了新的思路，提示对隐睾的干预或许应该提早到围生期。
参考文献
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3 Koch HM,Haller A,Weiss T,et al.Phthalate exposure during cold plastisol application—a human biomonitoring study.Toxicol Lett,2012,213:100-106.
4 Swan SH,Liu F,Hines M ,et al.Prenatal phthalate exposure and reduced masculine play in boys.Int J Androl ,2010,33:259-269.
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6 Parks LG,Ostby JS,Lambright CR,et al.The plasticizer diethylhexyl phthalate induces malformations by decreasing fetal testosterone synthesis during sexual differentiation in the male rat.Toxicol Sci,2000,58:339-349.
7 Kavlock R,Barr D,Boekelheide K,et al.NTP-CERHR expert panel update on the reproductive and developmental toxicity of di(2-ethylhexyl) phthalate.Reprod Toxicol,2006,22:291-399.
8 Kaftanovskaya EM,Feng S,Huang Z ,et al.Suppression of Insulin-Like3 Receptor Reveals the Role of β-Catenin and Notch Signaling in Gubernaculum Development.Mol Endocrinol,2011,25:170-183.
9 刘东尧，吴胜德,华燚，等.Notch1 在隐睾 SD 幼鼠睾丸组织中的表达及其意义.中国生物制品杂志,2013,26:962-965.