常规体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization- embryo transfer,IVF-ET)助孕治疗通常是在体外受精后16～18 h 剥除颗粒细胞，观察受精卵原核形成以判断卵子是否受精。但是，在IVF治疗中，个别患者会出现卵母细胞完全受精失败的现象，约占常规IVF周期的5%～10%[1]。对受精失败的卵子进行补救卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)是挽救卵子发育潜能的唯一方法。补救ICSI的应用最早是在加精后16～20 h，虽获得了较高的受精率和卵裂率，但临床结局仍不理想[2]。2003年，Chen 等[3]率先提出早期补救ICSI的理念，将补救ICSI的时间提前至加精后6 h，明显提高了受精及临床结局。本研究回顾性分析2011年1月至2013年12月期间完全受精失败的80个IVF周期，根据早受精判断的结果，61个周期进行了早补救ICSI，19周期因误判进行了晚补救ICSI，旨在探讨补救ICSI时机对受精失败患者胚胎发育和临床结局的影响。
对象与方法
1.研究对象及分组：2011年1月至2013年12月在本院生殖中心行常规IVF-ET助孕治疗，卵子完全受精失败的80个周期。患者年龄22～43岁，平均(32.7±4.5)岁，不孕年限1～13年，平均(5.3±3.3)年。其中，原发不孕56周期，继发不孕24周期。不孕原因中，输卵管盆腔因素49例、排卵障碍4例、子宫内膜异位症3例、男方少弱畸精10例、输卵管盆腔因素合并弱精子症13例，子宫腺肌症1例。根据WHO第五版人类精液检验与处理实验室手册[4]，取卵日男方精液前向运动精子百分率为8.4%～58.5%，平均(31.2±12.7)%，精子正常形态率为1%～21.7%，平均(7.4±4.6)%。根据补救ICSI的时机分为两组，受精后< 6 h即进行补救ICSI组为早补救组，受精后20 h补救组为晚补救组。
2.方法：(1) IVF/ICSI-ET。所有周期IVF/ICSI-ET 程序按照本中心张波等(2012年)报道的方法[5]；(2)早受精观察。受精后6 h内进行早受精情况观察，早受精重点观察对象为原发不孕、男方少弱畸精症、精子上游时间较长(>30 min)等。在倒置显微镜下观察，若卵子的颗粒细胞已大量脱落，有较多的精子黏附在卵子表面以及精子在受精滴里呈较快速直线前向运动的判定为受精成功。反之，则判定为受精失败高危对象。对怀疑受精失败的卵子进行早剥除颗粒细胞处理，以观察第二极体是否排出，对完全无第二极体排出的卵子即进行早补救ICSI。对判断为非受精失败高危患者的卵子将其从受精滴中捞至干净的培养滴中，直至第2天早上再进行剥除颗粒细胞观察受精情况，此时若发现受精失败即进行晚补救ICSI。(3)胚胎移植、黄体支持及妊娠检查。取卵后第1天开始肌肉注射黄体酮60～80 mg/d，2～3枚第2/3天卵裂期胚胎或单个第5/6天囊胚期胚胎在超声引导下行胚胎移植；所有囊胚均在其孵出前进行移植。移植后14 d 或12 d，查血hCG，若阳性则诊断为生化妊娠；移植后21～28 d，超声下见妊娠囊则诊断为临床妊娠。
3. 统计学处理：采用SPSS 17.0统计学软件包对数据进行处理，计数资料用χ2检验，计量资料采用t检验，P< 0.05为差异有统计学意义。
结果
1.两组患者基本情况比较：早补救ICSI组共61个取卵周期，移植52周期，另外9个周期因患者存在卵巢过度刺激风险或生殖道感染而取消移植；晚补救ICSI组共19个取卵周期，移植16周期，2周期因卵巢过度刺激风险和1周期因无可移植胚胎而取消移植。两组患者的平均年龄、平均不孕年限、平均获卵数和平均移植胚胎数比较，差异均无统计学意义。见表1。
表1早补救组和晚补救组患者基本情况比较
2.早补救组和晚补救组胚胎发育及临床结局情况：早补救组共获卵763枚，成熟卵子569枚，正常受精胚胎数485枚，多精受精4枚，卵裂胚胎数469枚，优质胚胎226枚。早补救组共移植94枚胚胎，27枚种植。晚补救组共获卵239枚，成熟卵子172枚，正常受精胚胎146枚，多精受精1枚，卵裂胚胎数144枚，优质胚胎34枚。晚补救组共移植30枚胚胎，种植6枚。早补救组相对晚补救组的成熟率、正常受精率、多精受精率和卵裂率差异均无统计学意义；而优质胚胎率、囊胚率和周期冷冻率均显著高于晚补救组，差异有统计学意义；临床妊娠率和种植率早补救组均高于晚补救组，差异无统计学意义。见表2。
表2早补救组和晚补救组胚胎发育及临床结局情况(%)
注：与晚补救组比较，*P<0.05。
讨论
受精过程包括精子穿透、皮质颗粒释放、第二极体释放以及原核形成。常规IVF受精率约60%～70%，但有部分周期由于各种原因会发生受精失败。受精失败的原因可能与精子穿透失败、卵子激活失败或卵子胞质不成熟或存在缺陷导致原核形成失败有关。对未受精的卵子进行补救ICSI是挽救卵子发育潜能的有效方法。以往补救ICSI的时间一般是在受精后22 h进行，卵母细胞老化错过了最佳受精时机，影响胚胎的发育潜能，以及胚胎发育与子宫内膜不同步导致临床妊娠率降低。因此，Chen等[3]提出常规IVF后应尽早判断卵母细胞是否受精，在卵子老化前及时进行补救ICSI。目前公认的观点认为第二极体的释放是卵母细胞成功受精最早的标志，第二极体释放的平均时间为2 h 39 min，最长不超过8 h[6]。常规IVF精卵共培养2 h即可受精，6 h后90%的受精卵排出第二极体，受精8 h后所有的受精卵都可以排出第二极体。有研究发现，卵母细胞的受精窗只有10 h左右[6]，理论上只要在该时间段内受精，对受精率和受精卵随后的发育不会造成不利影响。IVF后6 h 卵子仍处于受精窗内，此时对判断为未受精的卵母细胞进行早补救ICSI，在理论上是可行的。本研究采用早受精观察结合“捞蛋”的方法进行短时受精，于受精后约6 h在倒置显微镜下通过观察卵母细胞的颗粒细胞脱落情况、精子与颗粒细胞和透明带的黏附情况对卵子的受精情况进行初步判定。如有怀疑受精失败则再进一步剥除颗粒细胞观察第二极体是否排出，无怀疑的则将受精卵捞至干净的培养滴中直至次日早上再行剥除颗粒细胞。早受精观察结合捞蛋方法，一方面避免了过早剥除颗粒细胞对卵子造成机械刺激以及破环卵母细胞和卵丘细胞之间的微环境，另一方面将卵子从受精滴中捞出缩短了精卵共培养的时间，减少了不利于胚胎发育的因素，增加了优质胚胎率并提高了临床妊娠率[7]。但是，通过早受精观察也不可避免有极少数的周期(3%)因误判而未能尽早补救ICSI，直至第二天早上剥除颗粒细胞未见原核形成才给予补救ICSI。造成误判的主要原因是各实验员对早受精判断的经验水平差异引起的。
目前，普遍的观点认为早补救ICSI的胚胎发育潜能和临床妊娠结局优于晚补救ICSI。沙爱国等[8]研究表明，IVF后6 h 行早期补救ICSI能提高常规IVF卵子的利用率，并获得与常规ICSI相似的临床妊娠结局。刘晓妍等[9]研究表明，受精后22 h补救ICSI组其受精数和卵裂数显著低于6 h早期补救组，并且22 h组13个可移植周期中无1例获得临床妊娠。本研究也显示，晚补救ICSI组的优质胚胎率、囊胚率和周期冷冻率均显著低于早补救组。说明晚补救组由于卵子老化进而影响了胚胎的后续发育能力，导致优质胚胎率减少[10]。本研究中，早补救组的临床妊娠率和种植率均高于晚补救组，但差异不显著，原因可能有(1)晚补救组样本量较小，未来尚需进一步扩大样本量进行统计；(2)尽管是进行晚补救ICSI，但仍可获得一定的优质胚胎率(23.6%)，而移植时优先选择优质胚胎进行移植，这些胚胎往往具有较高的发育潜能。
采用早补救ICSI后，ICSI的适应证被进一步严格控制。孙海翔[11]报道，实行早期补救ICSI，常规ICSI周期由原来的25%～35%下降到15%～25%，而受精失败尤其是完全受精失败的发生率并没有增加。受精后6 h 补救ICSI可以显著增加卵子受精率、优质胚胎率、囊胚率和周期冷冻率，并明显提高临床妊娠结局。因此，临床上对原发不孕、男方少精子症、弱精子症的患者在精液足够行常规IVF的情况下可以采用卵子与精子受精6 h后，通过早受精观察结合剥除颗粒细胞观察第二极体的方式判断卵子是否受精。如果此时卵子未受精，及时补救ICSI仍能有效挽救卵子的发育潜能。
参考文献
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2 Nagy ZP,Joris H,Liu J,et al.Intracytoplasmic single sperm injection of 1-day-old unfertilized human oocytes.Hum Reprod,1993,8:2180-2184．
3 Chen C,Kattera S.Rescue ICSI of oocytes that failed to extrude the second polar body 6 h post-insemination in conventional IVF.Hum Reprod,2003,18：2118-2121.
4 谷翊群.世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册(第五版).北京：人民卫生出版社,2011:13-113.
5 张波，冯贵雪，周红，等.选择性单囊胚移植在降低多胎率中的应用.国际生殖健康/ 计划生育杂志，2012,31:38-41.
6 Nagy ZP,Janssenswillen C,Janssens R,et al．Timing of oocyte activation，pronucleus formation and cleavage in humans after intracytoplasmic sperm injection(ICSI)with testicular spermatozoa and after ICSI or in-vitro fertilization on sibling oocytes with ejaculated spermatozoa.Hum Reprod,1998,13：1606-1612．
7 张若鹏,邵华,张丽容,等．短时受精对体外受精-胚胎移植质量与妊娠卒的影响.生殖医学杂志,2004,13:44-46.
8 沙爱国,蒋晓明,任建枝,等.常规体外受精失败卵母细胞行早期补救卵胞浆内显微注射的临床应用价值.生殖医学杂志,2011,20:201-205.
9 刘晓研,张守信,沈肖芳,等.缩短挽救性ICSI卵龄有助于改善完全受精失败周期的结局.中国计划生育和妇产科,2012,4:37-40.
10 Yuzpe AA,Liu Z,Fluker MR.Rescue intracytoplasmic sperm injection(ICSI)-salvaging in vitro fertilization (IVF) cycle after total or near total fertilization failure.Fertil Steril,2000,73:1115-1119.
11 孙海翔.早期补救ICSI的安全性和应用价值.生殖医学杂志,2009,18:195-197.