子痫前期是妊娠期特有疾病，主要表现为高血压、蛋白尿、凝血功能障碍等，是产科常见的严重影响孕产妇健康的疾病之一[1]。本研究通过构造轻度及重度子痫前期SD大鼠动物模型，采用免疫组化方法(SP法)和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测[2]实验组SD鼠模和对照组SD鼠模胎盘组织中VEGF、IL-18和LP蛋白和mRNA的表达,探讨检测指标在子痫前期发病中的作用，为临床早期干预提供理论依据。
材料与方法
1.材料：实验动物SD(sprague dawley)清洁级雌性大鼠90只,2～3月龄，体重220～250 g,购自南方医科大学动物实验中心，严格试验标准饲养。于发情期与雄性SD大鼠合笼，观察脱落阴栓，阴栓脱落日定为妊娠第1天。雌鼠随机均分为3组，每组30只。在妊娠第13天开始给轻度子痫前期组皮下注射l ml(75 mg/kg)亚硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)(购自美国Sigma公司)，重度子痫前期组皮下注射l ml(150 mg/kg)L-NAME，对照组仅以生理盐水l ml皮下注射，各组每天1次，连续7 d。
2.血压测定：采用LE5007型大鼠尾压心率测定仪(美国Biopac公司)。测量各组孕鼠安静、清醒状态下尾动脉收缩压(mmHg),连续测量3次,取其均值。分别于妊娠第13天给药前和妊娠第21天取材前各测量1次。
3.尿液采集与尿蛋白测定：将各组孕鼠置代谢笼中,留取妊娠第12天上午8点至次日上午8点及妊娠第20天上午8点至次日上午8点的24 h尿液。用连苯酚红染料法测定24 h尿蛋白(美国Biopac公司)。
4.SD大鼠造模结果：皮下注射L-NAME后，孕鼠尾动脉收缩压显著升高，24 h尿蛋白亦显著升高，且呈剂量依赖。妊娠第14天(给药前),3组孕鼠尾动脉收缩压及24 h尿蛋白在同一水平，而妊娠第21天(给药后)，轻、重度子痫前期组高对照组，见表1。
5.标本采集：确定轻、重度子痫前期组和对照组大鼠动物模型造模成功，于妊娠第21天进行标本采集，各组每只鼠模处死后迅速剖出胎盘组织，每只鼠模胎盘组织分2份，每份约1 cm2，一份置于10%福尔马林溶液用于免疫组化,一份装入冻存管后入液氮保存，用于RT-PCR检测。
6.链霉素亲和生物素过氧化物酶法(SP法染色)：石蜡切片、脱蜡，将切片置入0.1 mmol/L枸橼酸盐缓冲液中，加热至100 ℃持续15 min，滴加3%H2O2，PBS洗5 min，共洗涤3次。每张切片滴加50 μl一抗(羊抗人VEGF多克隆抗体按1∶25稀释，兔抗人IL-18多克隆抗体按1∶50稀释,兔抗人leptin多克隆抗体按1∶50稀释，均为美国SantaCruz公司)，滴加生物素标记的二抗置于湿盒内37 ℃孵育10 min，PBS洗5 min，共洗涤3次，滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液，37 ℃孵育10 min，PBS洗5 min，共洗涤3次，滴加DAB显色液，室温显色10 min，镜下观察显色深浅。
7.RT-PCR方法：采用Trizol一步法提取胎盘组织总RNA，反应总体积20 μl，RNA模板量1 μg，参照试剂盒说明进行逆转录。PCR反应条件为90 ℃预变性5 min，90 ℃变性40 s、60 ℃退火1 min，70 ℃延伸1 min，在PCR扩增仪上(美国Perkini Elmer公司产品)共完成25个循环。取5 μl PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，β肌动蛋白(β-actin)作为内参照，紫外透射成像系统显像，测定特异条带的密度并与内参照比较，得出目的基因mRNA的相对表达量。引物及试剂盒由大连宝生物公司提供，引物序列由上海普迈生物科技有限公司(Invitrogen中国)合成，见表2。以目的基因的PCR扩增片断灰度与相应看家基因扩增片断灰度的比值，作为mRNA表达水平的相对参数。
表1L-NAME对3组SD大鼠模型的影响
注：与对照组给药后比较，*P<0.05；与重度子痫前期组给药后比较，#P<0.05
表2VEGF、IL-18和Leptin基因RT-PCR引物
8.统计学处理：VEGF、IL-18和LP免疫组织化学和RT-PCR结果采用SPSS 19.0软件进行统计分析,计量资料以
表示，多组比较采用单因素方差分析，采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1.3组SD鼠模胎盘组织中VEGF、IL-18和LP的表达：VEGF主要表达于合体滋养细胞的胞膜和胞质、细胞滋养细胞及血管内皮细胞的胞质中；IL-18主要表达于胎盘合体滋养细胞和绒毛毛细血管内皮细胞的胞膜、间质细胞胞膜；LP主要表达于细胞的胞膜、胞浆及核膜上，见图1。
2.3组SD鼠模胎盘组织中VEGF、IL-18和LP的蛋白相对表达量比较：轻、重度子痫前期组胎盘组织中VEGF、IL-18和LP蛋白相对表达量比较,差异有统计学意义；轻、重度子痫前期组胎盘组织中VEGF、IL-18和LP蛋白相对表达量分别于对照组比较，差异有统计学意义。VEGF在对照组、轻、重度子痫前期组的表达逐渐下降，IL-18和LP表达逐渐增强，见表3。
图1 3组VEGF、IL-18和LP的表达(免疫组化，×400) A为对照组胎盘组织中VEGF阴性表达；B为轻度子痫前期组胎盘组织中VEGF阳性表达；C为重度子痫前期组胎盘组织中VEGF阳性表达；D为对照组胎盘组织中IL-18阴性表达；E为轻度子痫前期组胎盘组织中IL-18阳性表达；F为重度子痫前期组胎盘组织中IL-18阳性表达；G为对照组胎盘组织中LP阴性表达；H为轻度子痫前期组胎盘组织中LP阳性表达；I为重度子痫前期组胎盘组织中LP阳性表达
表33组SD大鼠模型胎盘组织中VEGF、IL-18和LP蛋白相对表达量比较
注：与对照组比较，*P<0.05；与重度子痫前期组比较，#P<0.05
3.3组SD鼠模胎盘组织中VEGF、IL-18和LP的mRNA表达：3组胎盘组织中VEGF、IL-18和LP的mRNA比较，差异有统计学意义；轻、重度子痫前期组VEGF比较，差异有统计学意义，见图2、3及表4。
图2 3组SD鼠模胎盘组织中VEGF、IL-18和LP的mRNA表达 M为内参，β-actin 532 bp；1为对照組；2、3分别为轻、重度子痫前期组；A为VEGF RT-PCR电泳图；B为IL-18 RT-PCR电泳图；C为LP RT-PCR电泳图
图3 3组胎盘组织中VEGF、IL-18和LP的mRNA表达
表43组大鼠模型胎盘组织中VEGF、IL-18和LP的mRNA表达
注：与对照组比较，*P<0.05；与重度子痫前期组比较，#P<0.05
讨论
稳定而实用的动物模型是研究一种疾病病理机制及基础策略。本实验利用L-NAME皮下注射的方法建立子痫前期大鼠模型，结果显示L-NAME作用轻、重度子痫前期组和对照组孕鼠相比,出现明显的血压升高，尿蛋白水平升高的子痫前期临床疾病特征，可认为模型的建立是成功的[3]。VEGF是针对内皮细胞特异性最高，促血管生长作用最强的促有丝分裂因子，在刺激新血管发生与生长及维持血管壁的完整性和通透性方面均有重要意义。妊娠时VEGF及受体在母体胎儿胎盘均有较高的表达，对受精、着床、胎盘血管形成及胎儿生长发育等有重要作用[4]。VEGF的生理功能是促进内皮细胞分化、增生、迁移、浸润，调节血管发生和维持血管内皮功能，在促进血管形成，增加血管通透性，维持血管内膜的完整性方面发挥重要作用。IL-18蛋白在胎盘组织中主要表达于合体滋养细胞及细胞滋养细胞浆内,血管内皮细胞和绒毛间质细胞胞质内也有少量表达,偶见于胞核。IL-18既是一种炎症因子,又是一种免疫调节因子,同时又参与了胎盘的形成,故在子痫前期发病过程中担当着很重要的角色[5]。LP是由肥胖基因编码的分泌性蛋白质,主要由白色脂肪组织产生，血浆中绝大部分与蛋白质结合，小部分以游离形式存在发挥其生物学效应，LP是通过与其受体的结合来发挥生物学效应的,是一种作用于多靶器官、多功能的脂肪细胞因子,在正常妊娠及病理妊娠中均起到了重要作用[6]。本实验研究通过建立SD大鼠动物模型，检测VEGF、IL-18和LP在轻度及重度子痫前期实验组和对照组胎盘组织中的表达差异，实验结果显示,轻、重度子痫前期组胎盘组织中VEGF、IL-18和LP蛋白表达均较对照组有差异，轻、重度子痫前期组SD大鼠模型组中胎盘组织VEGF、IL-18和LP表达变化，造成胎盘血管发育受限，滋养细胞缺氧而导致浸润不足，胎盘缺血缺氧，血管内皮受损，最终导致子痫前期的发生。胎盘来源的IL-18和LP增加是子痫前期IL-18和LP水平升高的主要原因,且其增加的程度与子痫前期程度有关，而VEGF变化程度反之。对照组、轻、重度子痫前期组大鼠模型组胎盘组织的IL-18和LP mRNA表达逐渐升高。对照组、轻、重度子痫前期组大鼠模型组胎盘组织的VEGF mRNA表达逐渐下调。轻、重度子痫前期组大鼠模型组胎盘组织的VEGF mRNA表达有差异。考虑在各型子痫前期SD大鼠模型胎盘组织中VEGF表达逐渐降低，影响胎盘血管生成,导致妊娠早期胎盘浅着床及胎盘血管重铸障碍,胎盘缺血缺氧，使血管内皮的完整性受损,并影响胎盘血管的形成,造成胎盘血流减少,进一步损伤了血管内皮细胞的功能。
参考文献
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2 Aris A,Benali S,Ouellet A,et al.Potential biomarkers of preeclampsia:inverse correlation between hydrogen peroxide and nitric oxide early in maternal circulation and at term in placenta of women with preeclampsia.Placenta,2013,30:342-347.
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