子宫内膜异位症简称内异症，是指具有生长功能的子宫内膜组织(腺体和间质)出现在子宫内膜以外部位，其好发部位为卵巢、直肠子宫陷凹等。育龄妇女的发病率为10%～15%[1]，且有明显上升趋势，有“现代病”之称。主要引起不孕、痛经、慢性盆腔疼痛、盆腔包块、月经异常等，其发病机制复杂、病变广泛、形态多样，极具侵袭和复发性，有诸多棘手问题函待解决。由于异位的子宫内膜可引起一系列慢性炎症反应，导致腹膜粘连和骨盆变形[2]。子宫内膜异位症是腹痛和不孕的常见原因之一，然而，由于内异症临床症状多样，诊断较难，其金标准是通过腹腔镜对异位的子宫内膜取活检行组织学检查，此检查为侵入性检查，临床广泛应用较困难，因此寻找一种简单的非侵入性的检查方法是医务工作者一直关心的重点。
子宫内膜异位症的一些具有诊断价值的生物化学标记物如细胞因子，激素和生长因子，生物化学标记物与体格检查或者影像学检查比较，对轻度或中度内异症患者的临床价值不可估量。目前临床常用的标记物对于各种类型的内异症不是最准确的[3]。激活素属于转化生长因子(TGF)β超家族，已经证实脑、性腺、垂体、卵巢、胎盘等组织中存在激活素，正常的子宫内膜及异位的子宫内膜均可以产生[4]。且发现它具有多种生物学作用，调节细胞滋养层分化，提高单核细胞向巨噬细胞转化的转化率，调节前列腺素和细胞因子的表达，和女性生殖有关的主要是激活素A(ACTA)。ACTA在女性生殖功能中的作用包括调节性激素产生、调节卵泡发育、促进黄体溶解、参与性腺性别决定等[5]。此外，ACTA还具有调节细胞的增殖性、粘附性、侵袭性及影响血管形成等生物学作用。ACTA在月经周期中参与子宫内膜蜕膜化便于胚胎着床，在流产、无排卵性出血及内异症妇女中异常表达[6]。卵泡抑素是激活素的天然拮抗剂，是激活素的主要调节者，卵泡抑素和激活素紧密连接，并阻碍激活素和激活素受体ActRⅡ结合，卵泡抑素在正常子宫内膜和异位的子宫内膜组织中大量表达[7]。曾经有研究显示在卵巢型内异症的患者的腹水中发现卵泡抑素明显升高，而在无卵巢疾病的内异症者中中度升高[8]。
对象与方法
一、对象
收集本院2008—2014年均行腹腔镜检查并行组织检查确诊为子宫内膜异位症139例，均排除自身免疫性疾病、肝脏疾病、恶性肿瘤，且3个月内未服用甾体类激素药物。腹膜型内异症组28例，卵巢型内异症组61例，深部浸润型内异症组50例。同期无内异症但要求人工流产的患者75例为对照组，近期无口服甾体类激素及腹腔镜手术。
二、方法
1.血液标本：患者在行腹腔镜术前收集外周静脉血标本于促凝管中，在室温下以400 rmp/s离心10 min，吸取上清，在-80 ℃冰箱冻存3～8个月。
2.激活素A和卵泡抑素检测：采用酶联免疫试剂盒(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)检测激活素A和卵泡抑素，吸取100 μl稀释液，100 μl样本和标准液加入到覆有抗体的96孔板中，检测激活素A时在室温下孵育3 h，检测卵泡抑素时则在4 ℃下孵育，用缓冲液清洗测试孔，并吸干，再加入二抗孵育1～2 h，充分清洗后，在室温下加入显色液(四甲基联苯胺)显色30 min，加入2N硫酸终止反应，最后在45 nm处检测吸光度。这个试剂盒激活素A的检测范围限于4 pg/ml，其线性检测范围是15～1 000 pg/ml。而卵泡抑素的检测范围限于29 pg/ml，其线性检测范围是250～16 000 pg/ml。
3.相关定义：腹膜型内异症是指盆腹腔腹膜的各种内异症病灶；卵巢型内异症是子宫内膜异位到卵巢，形成卵巢囊肿，至少有一侧卵巢囊肿；深部浸润型是指异位的子宫内膜累及到宫韧带、直肠子宫陷凹、阴道穹窿、直肠阴道隔等。ASRM评分(Scoring System of the American Society for Reproductive Medicine)是指目前最常用的美国生殖医学会关于内异症分类分期系统，依照形态、外观、侵袭的区域、深度、范围等区分分期等级。根据美国生育协会(American Fertility Society)关于内异症分期修订版(r-AFS评分)，根据病灶大小、粘连范围、累及部位等评分将子宫内膜异位症分为4期，包括I期1～5分；II期6～15分，III期16～40分；IV期>40分。身高体重指数(body mass index，简称BMI)又称身体质量指数，体重(kg)/身高(m)2，比较及分析一个人的体重对于不同高度的人所带来的健康影响时，BMI值是一个中立而可靠的指标。视觉模拟评分法(Visual Analogue Scale,VAS)用于疼痛的评估，在中国临床使用较为广泛，基本的方法是使用一条长约10 cm的游动标尺，一面有10个刻度，两段分别为“0”分端和“10”分端，0分为无痛；3分以下为轻微疼痛，能忍受；4～6分为疼痛并影响睡眠，尚能忍受；7～10分为渐强烈的疼痛，疼痛难忍，影响食欲。肠道症状多为腹部可触及包块，直肠和乙状结肠累及者可出现排便困难、腹泻、便秘、排便痛和血便，累及小肠多见于回肠末端，常发生中腹部痉挛性疼痛。泌尿系统症状包括发生在膀胱者，症状多样，可出现尿频、尿急、排尿困难、膀胱区疼痛和盆腔后背痛；可出现周期性肉眼血尿；累及输尿管可出现类似于泌尿系感染症状。
4.统计学处理：采用SPSS 17.0统计软件处理，计量资料以(均数±标准差)表示，采用t检验；计数资料采用X2检验；以P<0.05为差异有统计学意义。运用接受者操作特征(ROC)曲线检测激活素A和卵泡抑素单独及联合(激活素A×卵泡抑素)在子宫内膜异位症及其亚型诊断中的灵敏度和特异度。
结 果
一、4组临床资料比较
4组的ASRM评分、Ⅰ～Ⅱ期、肠道症状、泌尿系症状比较，差异具有统计学意义，见表1。
表1四组临床资料比较
注：#P<0.05
二、4组ACTA和卵泡抑素比较
对照组、腹膜型内异症组、卵巢型内异症、深部浸润型内异症ACTA分别为(0.17±0.01)ng/ml、(0.19±0.01)ng/ml、(0.22±0.01)ng/ml、(0.16±0.02)ng/ml(图1A)，卵巢型内异症组血清ACTA明显高于对照组。
对照组、腹膜型内异症组、卵巢型内异症组、深部浸润型异症组卵泡抑素浓度分别为(1.69±0.07)ng/ml、(2.24±0.42)ng/ml、(2.34±0.32)ng/ml、(1.50±0.17)ng/ml(图1B)，腹膜型内异症组、卵巢型内异症组、卵泡抑素浓度略高于对照组，但差异无统计学意义；腹膜型和卵巢型内异症组比深部浸润型内异症组卵泡抑素浓度高，差异有统计学意义。
当ACTA和卵泡抑素相乘共同建立一个双标记指数时，卵巢型内异症组与对照组双标记指数比深部浸润型内异症组明显升高；腹膜型内异症组双标记指数与卵巢型内异症组相似，与对照组无差异(图1C)。
内异症的激活素A、卵泡抑素和双标记物指数与对照组比较的ROC曲线见图1D。ACTA的ROC曲线下的面积为0.700(95%CI为0.605～0.794)，卵泡抑素的ROC曲线下面积为0.620(95%CI为0.510～0.730)，两项指标联合呈双标记物指数不能提高诊断准确率。激活素A×卵泡抑素的ROC曲线面积为0.696(95%CI为0.596～0.795)，双标记物指数面积与单个指标面积无区别(图1D)。这两项标记物的准确率中等(表2)，用界值点为90%特异度时，ACTA的灵敏度为33.0%，阳性似然比为2.78，卵泡抑素的灵敏度为37.0%，阳性似然比为3.94，两项指标联合时灵敏度为41.0%，阳性似然比为4.41。
图1 4组血清ACTA(A)，卵泡抑素水平(B)，双标记物指数(激活素A×卵泡抑素，C)及ACTA、卵泡抑素和双标记物指数的ROC曲线(D)
注：#与*比较，P<0.05
表2激活素A、卵泡抑素及双标记物指数(激活素A×卵泡抑素)诊断卵巢子宫内膜异位症的灵敏度和阳性似然比对应的90%特异度界值
讨 论
新的生物学标记物的发现在子宫内膜异位症的研究中一直是热点话题[9]。由于临床症状的特异度和灵敏度不高，在诊断内异症时首先考虑非侵入性的生物化学检查方法，也可以减少不必要的腹腔镜检查。到目前为止，CA125是临床上唯一用于诊断内异症的生化标记物，尽管CA125的灵敏度很低[10]。CA15和多种循环标记物如抗心磷脂抗体，TNF-α，IL6，IL8，CA199，由于没有一项指标是内异症特有的，因此其准确率低。
ACTA是一种由子宫内膜产生的生长因子，其活性由卵泡抑素结合蛋白调整，两种蛋白都可以在外周血清中检测到，其浓度子宫内膜异位症患者血清中升高。Reis等[4]及Mabuchi等[11]的研究发现ACTA正常子宫内膜、内异症组在位内膜和异位内膜均表达。研究已经证实内异症组在位内膜和异位内膜较正常子宫内膜能产生更多的ACTA，说明ACTA在内异症的发病中可能起作用。Florio等[12]在腹腔组织和培养的子宫内膜异位细胞中发现有卵泡抑素α、激活素β A、激活素β B及激活素受体的mRNA的表达，在培养液中也能测到卵泡抑素相关蛋白，而且腹腔液中INHA、INHB和ACTA水平远高于血清。
本文研究ACTA和卵泡抑素是否可能成为诊断腹膜型、卵巢型及深部浸润型内异症的生化标记物。因为ACTA和卵泡抑素均由子宫内膜和异位的子宫内膜产生和释放，并且可以用一定的方法在外周血血清中检测的到，因此选择它们作为研究对象。另外，有研究表明在卵巢型内异症患者血清中卵泡抑素浓度升高[13]。董婕等[14]研究表明ACTA和卵泡抑素在子宫内膜异位症患者中表达增高。
本实验结果并未发现卵泡抑素浓度在内异症患者中明显升高，可能是因为患者血液标本差异导致，事实上，本研究中在卵巢型内异症中ACTA浓度中度升高，深部浸润型内异症患者卵泡抑素浓度与其他几种类型内异症患者仅有很微小的差别。子宫内膜异位症的类型不同，决定了它所产生和释放的生物标记物也有所不同[15]。CA125是最典型的例子，它在深部浸润型和盆腔粘连型子宫内膜异位症患者中浓度比其它类型内异症明显升高。ACTA浓度在深部浸润型内异症患者比对照组明显升高，但是没有研究证明ACTA浓度与子宫内膜异位的部位有关[16]。有趣的是，在功能性子宫出血但是子宫内膜正常的患者中，深部的子宫内膜往往是未分化的，它可以影响激活素和卵泡抑素的产生[17]。
ACTA和卵泡抑素联合应用在任何界值点都没有达到较佳的灵敏度和特异度，如同ROC曲线显示，二者联合也没有提高诊断准确率。患者生物标记物水平差异大是由于一部分患者血清中ACTA和卵泡抑素的水平比一般人高，而一部分人与一般人无任何差异。
ACTA在卵巢型内异症患者的囊液中明显升高，并且在内异症患者子宫内膜增生期过表达，但是这种升高的浓度不能持续太久。因此ACTA的诊断内异症时低灵敏度是因为在多种组织表达。在一项系统回顾中有提到ACTA的低灵敏度成为限制了其成为内异症的生化标记物的主要原因。因此亟需寻找另一种特异性的标记物和ACTA联合应用提高内异症的准确性。
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