子痫前期是妊娠期高血压疾病的一种，属于妊娠期特发的全身性疾病之一。临床主要表现为蛋白尿和高血压。研究表明，滋养细胞浸润过浅，胎盘植入不完全，胎盘血管重塑障碍、血流灌注不足是导致子痫前期的重要原因之一[1-3]。内皮糖蛋白(Endoglin)是转化生长因子β(transforming growth factor, TGF-β)受体复合物的主要成分之一，高表达于内皮细胞，是内皮组织增殖的重要标记物之一。Endoglin缺失时可导致血管发育不全，过多则可能诱发血管增生。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是具有强烈促血管生长作用的糖蛋白之一，通过与血管内皮细胞表面的特异性受体结合发挥活性。血管内皮生长因子受体1(fms-like tyrosine kinase receptor 1, Flt-1)是VEGF高亲和性受体之一，与VEGF结合后可抑制血管增殖功能。本研究通过免疫组化法观察轻、重度子痫前期患者及正常足月产妇血清、胎盘组织中Endoglin、VEGF及Flt-1的表达，以期为阐明其病理机制提供依据。
对象与方法
一、对象
选取南方医科大学附属深圳妇幼保健院2010年10月—2012年1月收治的子痫前期患者45例；年龄19～36岁，平均(30.1±5.3)岁；孕周33～41周，平均(37.6±3.6)周。其中轻度子痫前期组15例，年龄21～36岁，平均(31.2±6.4)岁；孕周33～40周，平均(38.1±4.0)周。重度子痫前期组30例，年龄19～34岁，平均(30.2±5.8)岁；孕周34～41周，平均(37.0±3.3)周。选择同期住院行剖宫产分娩的正常足月妊娠孕妇20例(对照组)，年龄20～35岁，平均(28.3±5.1)岁；孕周33～40周，平均(38.2±4.5)周。3组孕妇均为单胎初产，既往均无肝炎、结核等急、慢性传染病史等。3组年龄、孕周比较，差异无统计学意义。
二、方法
1.诊断标准：诊断和分度标准参照第8版《妇产科学》。轻度子痫前期为妊娠20周后出现收缩压≥140 mmHg和(或)舒张压≥90 mmHg，伴蛋白尿≥0.3 g/24 h或随机尿蛋白(+)。重度子痫前期为血压和尿蛋白持续升高，发生母体脏器功能不全或胎儿并发症。出现下述任一不良情况可诊断重度子痫前期：①血压持续升高，收缩压≥160 mmHg和(或)舒张压≥110 mmHg；②蛋白尿≥5.0 g/24 h或随机蛋白尿≥(+++)；③持续性头痛，或视觉障碍，或其他脑神经症状；④持续性上腹部疼痛，肝包膜下血肿或肝破裂症状；⑤肝脏功能异常，肝酶ALT或AST水平升高；⑥肾脏功能异常，少尿(24 h尿量<400 ml或每小时尿量<17 ml)或血肌酐>106 μmol/L；⑦低蛋白血症伴胸水或腹水；⑧血液系统异常，血小板呈持续性下降并低于100×109/L；血管内溶血、贫血、黄疸或血LDH升高；⑨心力衰竭、肺水肿；⑩胎儿生长受限或羊水过少；
早发型即妊娠34周以前发病。
2.主要仪器和试剂：自动切片机(RMZ135，德国Leica)；光学显微镜(BH-2，日本Olympus)；电热恒温干燥箱(DHG-9140A，上海精密实验设备有限公司)；医用微波炉(YWY781-B，格兰仕)；密闭式程控组织脱水机(PATHCENTRE，美国Shandon)；全自动生化免疫分析仪(VITROS 5600 Integrated System，Ortho-Clinical Diagnostics,Inc)；鼠抗人Endoglin单克隆抗体(ab11414，Abcam)；鼠抗VEGF单克隆抗体(ab1316，Abcam)；鼠抗Flt-1单克隆抗体(ab9540，Abcam)；二抗Donkey Anti-Mouse IgG(ab150105，Abcam)；人血Endoglin、VEGF及Flt-1试剂盒购于上海卡奴ELISA试剂有限公司；免疫组化SP试剂盒及DAB试剂盒均由北京中杉金桥生物技术有限公司。
3.实验方法：所有研究对象均于胎盘娩出后，于脐带附着处母体面切取全层胎盘组织1 cm3，以生理盐水冲洗后固定于福尔马林溶液(10%)。常规脱水，石蜡包埋，以自动切片机连续切片，片厚3 μm。所得石蜡切片进行常规免疫组化实验，步骤如下。①脱蜡至水，3% H2O2孵育10 min，蒸馏水冲洗2～3次，PBS浸泡5 min，置于构椽酸盐缓冲液进行抗原修复，98 ℃ 20 min，28 ℃ 20 min，PBS冲洗2～3次。②山羊血清工作液封闭，28 ℃ 10 min，一抗孵育(Endoglin、VEGF和Flt-1的稀释浓度均为10 μg/ml)37 ℃ 60 min，PBS冲洗3次。③二抗孵育37 ℃ 20 min，抗体稀释浓度5～8 μg/ml，PBS冲洗3次。④辣根酶标记链酶卵白素工作液孵育，37 ℃ 20 min，PBS冲洗3次。⑤自来水冲洗3～4次，苏木素复染，脱水，封片。
图1 3组胎盘组织中Endoglin蛋白的免疫组化结果 (苏木素染色，×400)
注：A为对照组；B为轻度子痫前期组；C为重度子痫前期组；D为Endoglin的表达量
图2 3组间胎盘组织VEGF蛋白的免疫组化结果(苏木素染色，×400)
注：A为对照组；B为轻度子痫前期组；C为重度子痫前期组；D为VEGF的表达量
4.数据处理方法：每例标本选取一张切片，每张切片选取5个视野。免疫组织化学染色后，胞膜或胞质内有棕黄色颗粒者为阳性，参照Hao综合记分法来观察阳性强度和阳性率。即根据染色程度记为0(不显色)，1(浅黄色)、2(棕黄色)、3分(深黄色)；根据阳性细胞百分比记为0(<5%)、1(5%～35%)、2(36%～65%)、3分(>65%)；以二者均值作为阳性强度的衡量标准，<0.5为阴性，0.5～1.0为阳性(+)，1.5～3.0为强阳性(++)；阳性率为“+”和“++”患者所占百分比。用Biosens彩色图像分析系统计算总灰度及切面面积，取单位面积的平均灰度值代表蛋白表达量。
5.统计学处理：以SPSS 16.0统计学软件进行数据分析；阳性强度为等级资料，行秩和检验；阳性率行χ2检验；蛋白表达量以
表示，行F检验，组间两两比较行LSD-t检验；P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、 3组血清中Endoglin、VEGF及Flt-1的含量
对照组、轻度和重度子痫前期组血清中的Endoglin与Flt-1含量逐渐升高，VEGF含量逐渐降低，差异均有统计学意义，见表1。
二、 3组胎盘组织中Endoglin、VEGF及Flt-1的分布和表达
1. 3组胎盘组织中Endoglin的分布和表达：Endoglin主要分布于血管内皮细胞及合体滋养细胞的胞膜，见图1；重度、轻度子痫前期组及对照组的阳性表达率、表达强度及表达量依次降低，见表2。
表13组血清中Endoglin、VEGF及Flt-1的含量比较
注：与对照组比较，*P<0.05；与轻度子痫前期组比较，#P<0.05
表23组胎盘组织中Endoglin的表达情况比较
注：与对照组比较，*P<0.05；与轻度子痫前期组比较，#P<0.05；与对照组阳性表达程度分级比较，△P<0.05；与轻度子痫前期组阳性表达程度分级比较，△P<0.05
2. 3组胎盘组织中VEGF的分布和表达：VEGF主要分布于合体滋养细胞的胞膜和胞质、血管内皮细胞的胞质中，见图2；重度、轻度子痫前期组及对照组的阳性表达率依次降低，表达量依次升高，见表3。
3. 3组胎盘组织中Flt-1的分布和表达：Flt-1主要分布于胎盘合体滋养细胞和绒毛毛细血管内皮细胞的胞膜，此外，间质细胞胞膜、胞质亦有散在表达，见图3。重度、轻度子痫前期组及对照组的阳性表达率、表达强度及表达量依次降低，见表4。
三、Endoglin、VEGF及Flt-1蛋白表达的相关性
胎盘组织中Endoglin与VEGF、Flt-1的表达无关；VEGF与Flt-1的表达呈负相关(R2=0.7168)，见图4。
表33组胎盘组织中VEGF的表达情况
注：与对照组比较，*P<0.05；与轻度子痫前期组比较，#P<0.05；与对照组阳性表达程度分级比较，△P<0.05；与轻度子痫前期组阳性表达程度分级比较，△P<0.05
表43组胎盘组织中Flt-1的表达情况
注：与对照组比较，*P<0.05；与轻度子痫前期组比较，#P<0.05；与对照组阳性表达程度分级比较，△P<0.05；与轻度子痫前期组阳性表达程度分级比较，△P<0.05
图3 3组胎盘组织中Flt-1蛋白的免疫组化结果(苏木素染色，×400)
注：A为对照组；B为轻度子痫前期组；C为重度子痫前期组；D为Flt-1的表达量
图4 VEGF与Flt-1蛋白表达的线性相关图
讨 论
妊娠期高血压疾病是导致不良围生结局和围生儿死亡的主要原因之一，发病率约为7.0%～12.0%[4]。子痫前期是典型妊娠期高血压疾病之一，以蛋白尿、高血压、全身性水肿等为主要临床表现，严重时可发生抽搐、昏迷、休克等神经损伤症状，危机生命。越来越多的研究表明，广泛的血管内皮损伤是子痫前期的主要微观病理特征，常表现为全身小动脉痉挛[5-6]。其潜在发病机制尚未完全阐明，部分研究认为可能与滋养细胞浸润过浅，胎盘植入不完全，胎盘血管重塑障碍、血流灌注不足有关。本实验将研究重点放在血管的再生与重塑方面，以血管生成所必需的3种主要蛋白Endoglin、VEGF及Flt-1为主要观察指标，旨在探讨Endoglin、VEGF、Flt-1在子痫前期患者胎盘组织中的表达及临床意义。
本研究显示，对照组、轻度和重度子痫前期血清中的Endoglin与Flt-1含量逐渐升高，VEGF含量逐渐降低，初步说明该3项指标对子痫前期的病情评估可能有一定帮助。为进一步了解Endoglin、VEGF及Flt-1与子痫前期的相关性，本课题对其胎盘组织表达状态进行了深入研究。研究发现，在蛋白分布上，Endoglin和VEGF主要表达于血管内皮细胞及合体滋养细胞的胞膜或胞质，Flt-1在胎盘合体滋养细胞，绒毛毛细血管内皮细胞的胞膜及间质细胞的胞膜、胞质均有散在表达，可见3种因子可能主要与血管内皮细胞及合体滋养细胞的生长发育密切相关。在表达阳性率、表达强度及表达量方面，对照组、轻度和重度子痫前期组胎盘组织中Endoglin与Flt-1的逐渐升高，VEGF逐渐降低，该结果与血清含量具有良好的一致性。
Endoglin是TGF-β受体复合物的主成分之一，正常生理状态下，低表达于成熟的血管内皮细胞，高表达于在增殖状态的血管内皮细胞[7-8]。在妊娠周期中，Endoglin高表达于4～9周，10周之后开始降低[9]。主要生理功能为抑制细胞对TGF-β的反应，介导血管发生和重塑，过高时可能抑制滋养层细胞的滋养和浸润[10]。VEGF又称血管渗透因子，主要分泌于合体滋养细胞，用以促血管生长及增加微血管通透性。在机体血管生成必不可少的的诱导因子之一。在妊娠期，则能够促进胎盘血管网形成及滋养细胞生长[11-12]。
VEGF是典型供受型蛋白，与受体结合才能发挥生物学活性，与不同的受体结合可发挥不同的生物学效应。受体包括VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3三种形式，Flt-1即VEGFR-1，与VEGF结合后可抑制或阻断其血管增殖活性[13-15]。本研究也发现，胎盘组织中VEGF与Flt-1的表达呈负相关，说明子痫前期患者胎盘组织中Flt-1表达增加或VEGF表达降低，均可影响胎盘血管生成，导致妊娠早期胎盘浅着床。且Flt-1的表达与组织氧供有关，缺氧状态下可成倍升高，因此，浅着床胎盘缺血缺氧反应亦可增加Flt-1表达量，加重胎盘血管形成障碍，促进子痫前期的发展。
Endoglin、VEGF、Flt-1均为参与血管形成和重塑的重要因子，广泛分布于血管内皮细胞和合体滋养细胞，能够通过调节局部血管的生长发育介导胎盘着床过程，与子痫前期的发病和进展密切相关；且其血清含量与胎盘表达状态保持有良好的一致性，可作为该病临床诊断和病情评估的辅助指标。
(图1、图2见封三)
参考文献
1 罗欣,漆洪波.子痫前期发病机制分子生物学研究进展.中国实用妇科与产科杂志,2012,12:309-311.
2 杨智宇,陈立芬.可溶性血管内皮生长因子受体-1与胎盘生长因子在子痫前期诊断中的应用.国际妇产科学杂志,2013,40:222-225.
3 徐匆,刘伟.子痫前期胎盘学研究进展.中国实用妇科与产科杂志,2009,25:300-303.
4 刘松君,刘玮,姚慕昆,等.脂氧素A4对子痫前期患者脐静脉内皮细胞分泌内皮素-1的影响.中国妇幼保健,2011,26:3795-3797.
5 Bell M,Roberts J,Founds S,et al.Variation in endoglin pathway genes is associated with preeclampsia:a case-control candidate gene association study.BMC Pregnancy Childbirth,2013,13:82-89.
6 Kweider N,Fragoulis A,Wruck C,et al.Interplay between vascular endothelial growth factor (VEGF) and nuclear factor erythroid 2-related factor-2 (Nrf2):implications for preeclampsia.J Biol Chem,2011,286:42863-42872.
7 G
uchowska M,Kowalska-Koprek U,Karowicz-Bilińska A.Evaluation of the usefulness of endoglin level as a predictor of preeclampsia in pregnant women with hypertension.Ginekol Pol,2013,84:835-840.
8 Oujo B,Perez-Barriocanal F,Bernabeu C,et al.Membrane and soluble forms of endoglin in preeclampsia.Curr Mol Med,2013,13:1345-1357.
9 Bell M,Conley Y.A systematic review of endoglin gene expression in preeclampsia.Biol Res Nurs,2013,15:129-136.
10 Aggarwal P,Chandel N,Jain V,et al.The relationship between circulating endothelin-1,soluble fms-like tyrosine kinase-1 and soluble endoglin in preeclampsia.J Hum Hypertens,2012,26:236-241.
11 Gennari-Moser C,Khankin E,Mohaupt M,et al.Vascular endothelial growth factor-A and aldosterone:relevance to normal pregnancy and preeclampsia.Hypertension,2013,61:1111-1117.
12 Zhao M,Yin Y,Guo F,et al.Placental expression of VEGF is increased in pregnancies with hydatidiform mole:possible association with developing very early onset preeclampsia.Early Hum Dev,2013,89:583-588.
13 Kim S,Lim J,Ryu H,et al.Dinucleotide repeat polymorphism in Fms-like tyrosine kinase-1 (Flt-1) gene is not associated with preeclampsia.BMC Med Genet,2008,9:6-8.
14 Shibuya M.Involvement of Flt-1 (VEGF receptor-1) in cancer and preeclampsia.Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci,2011,87:167-178.
15 Lok C,Böing A,Sturk A,et al.Circulating platelet-derived and placenta-derived microparticles expose Flt-1 in preeclampsia.Reprod Sci,2008,15:1002-1010.