子宫腺肌病(adenomyosis，AM)是妇科常见的具有恶性肿瘤行为的良性病变，多发生于30～50岁的经产妇。据调查，在绝经前、绝经期和绝经后所占比例分别为80%、17%和3%[1]。近年来，AM的发病率呈上升趋势，且发病年龄呈年轻化。临床表现主要为经量过多，经期延长和逐渐加重的进行性痛经。近期有研究显示，AM与不孕的发生有关，可导致女性生殖能力受损[2]，但具体的机制仍不十分明确。因此，其治疗效果亦多不理想。近年来，国内外相继报道ANXA2、Vimentin在恶性肿瘤中的异常表达。本文旨在用免疫组化SP法检测ANXA2和Vimentin在AM异位内膜、在位内膜和子宫肌瘤正常内膜中的表达情况及不同月经周期间表达的差异，进一步分析上皮-间质细胞转化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)在AM中的发生及ANXA2是否与其具有相关性，从而为AM的临床治疗提供新的理论依据。
对象与方法
一、对象
选取2012年7月—2013年4月就诊于包头医学院第一附属医院妇科行子宫切除并经病理证实的AM标本35例，取在位内膜和异位内膜，增生期内膜25例，分泌期内膜10例。选取同期行子宫切除并经病理证实的子宫平滑肌瘤标本20例，取正常子宫内膜，增生期内膜10例，分泌期内膜10例。所有患者月经周期尚规律，无其他合并症，且在术前3个月内未接受过激素治疗。月经周期的划分根据月经史和子宫内膜病理结果判定。全部标本的HE切片均由病理科专家复查核对。AM患者年龄36～55岁，平均(44.4±4.1)岁；子宫平滑肌瘤患者年龄42～50岁，平均(45.6±2.5)岁。两组年龄差异无统计学意义。
二、方法
1.免疫组化SP法：将查找到的符合实验的组织蜡块重新包埋，然后取4 μm厚连续切片。常规脱蜡水化、抗原热修复后，严格按试剂盒(KIT-9710，购自福州迈新公司)说明书进行实验步骤。ANXA2抗体的稀释浓度为1:200(bs-0576R，购自北京博奥森公司)，Vimentin为即用型(RMA-0547，购自福州迈新公司)。自然晾干后阅片，阳性对照为试剂公司所提供的阳性片，PBS代替一抗作为阴性对照。
2.结果判定：由2位病理医师采用双盲法在光镜下进行观察和评定。每张切片随机选取5个视野，每个视野计数100个细胞。ANXA2主要表达于腺上皮细胞的细胞质和(或)细胞膜；Vimentin主要表达于间质细胞的细胞质和(或)细胞膜。二者阳性信号均为出现淡黄色、棕黄色或棕褐色颗粒。根据显色强度和阳性细胞百分率进行半定量判定。(1)按照显色强度分为无着色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别评为0、1、2、3分。(2)按照阳性细胞百分率计为<5%计0分，5%～25%计1分，26%～50%计2分，>50%计3分。最后根据两者乘积，(1)×(2)，将染色情况分为4级：0～1分为(-)，2～3分为(+)，4～6分为(++)，>6分为(+++)。乘积<2分判定为阴性(-)，≥2分判定为阳性(+)。
3.统计学处理：采用SPSS 11.5软件对数据进行统计分析。AM异位内膜、在位内膜和子宫肌瘤正常子宫内膜中ANXA2和Vimentin的阳性表达率用χ2检验及Fisher确切概率法，二者的相关性比较用Spearman相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。当使用χ2分割检验时，检验水准调整为α=0.0125。
结 果
一、ANXA2在AM组和正常内膜组中的表达情况
ANXA2主要表达于腺上皮细胞的细胞质和(或)细胞膜(图1)。ANXA2在AM异位内膜、在位内膜及子宫肌瘤的正常内膜中阳性表达率差异有统计学意义；ANXA2在AM异位内膜和在位内膜中的阳性表达率均高于正常内膜，在AM异位内膜中的阳性表达率高于在位内膜，差异均有统计学意义；ANXA2在AM异位内膜及在位内膜中增生期的阳性表达率均高于分泌期；见表1。
二、Vimentin在AM组和正常内膜组中的表达情况
Vimentin主要表达于间质细胞的细胞质和(或)细胞膜(图2)。Vimentin在AM异位内膜、在位内膜、子宫肌瘤正常内膜中阳性表达率的比较，差异有统计学意义；Vimentin在AM异位内膜和在位内膜中的阳性表达率均高于正常内膜，在AM异位内膜中的阳性表达率高于在位内膜，差异均有统计学意义；Vimentin在AM异位内膜及在位内膜中增生期的阳性表达率均高于分泌期，见表1。
图1 ANXA2表达的病理图(免疫组化SP染色，×100)
图2 Vimentin表达的病理图(免疫组化SP染色，×100)
表1ANXA2和Vimentin在AM异位内膜、在位内膜和正常内膜中的表达[例(%)]
注：三组ANXA2合计比较，χ2=24.130，P<0.05；与正常内膜组合计比较，*P<0.0125；与在位内膜组合计比较，#P<0.0125；与同组内分泌期比较，△P<0.05；三组Vimentin合计比较，χ2=23.095，P<0.05
三、ANXA2和Vimentin在不同组中表达的相关性
ANXA2与Vimentin在AM组中的表达呈正相关性(rs=0.298,P<0.05)，二者在正常内膜组中的表达无相关性(rs=0.140,P>0.05)，见表2。
表2ANXA2与Vimentin在AM、正常内膜组中表达的相关性
讨 论
一、ANXA2与AM
膜联蛋白(annexin)是一类由Ca2+介导的具有磷脂结合特性的膜蛋白质超家族，其中在脊椎动物细胞中称为膜联蛋白A家族[3]。ANXA2在人体细胞中以单体、异二聚体和异四聚体三种方式存在[4]。本实验得出ANXA2在异位内膜中的阳性表达率明显高于在位内膜及正常内膜组，在位内膜中的阳性表达率高于正常内膜组，提示ANXA2在AM的发生、发展中扮演着重要角色。AM虽为良性病变，但具有恶性肿瘤的行为，子宫内膜异位于肌层的病灶可存活和浸润，需要建立周围新生血管来供养，而血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前学者们所公认的促血管生成最关键的因子。有研究显示，ANXA2和S100A10组成的异四聚体可促进血管形成，通过与血管形成因子(如VEGF)及S100A4相互作用，在肿瘤侵袭和转移中发挥作用[5]。Zhou等[6]分别用免疫印迹法和免疫组化法得出相同结论，即ANXA2在AM中异位内膜的表达强度高于在位内膜，进一步的实验表明，ANXA2可通过激活缺氧诱导因子1a(Hypoxia inducible factor-1alpha,HIF-1a)/VEGF-A信号通路，使其在局部病变促进血管生成的能力加强；通过β-catenin/Tcf信号相关方式，发挥入侵和转移的潜能。AM具有类似于恶性肿瘤的黏附、侵袭和种植等生物学行为，其一系列复杂过程的完成均需要降解细胞外基质，而大量研究表明，细胞外基质中的所有成分几乎均可被基质金属蛋白酶(MMPs)所降解。ANXA2和S100A10组成的异四聚体可通过与内皮细胞分泌的组织型纤溶酶原激活物(t-PA)及其他各因素共同作用来加速纤溶酶原(PLG)生成纤溶酶(PL)，进一步激活基质金属蛋白酶家族酶原(pro-MMPs)为活化的MMPs，诱导胞外基质重塑，促进血管生成及肿瘤浸润转移[7]。因此，ANXA2可能通过以上这些途径在AM中发挥作用。本实验发现，ANXA2的阳性表达率在AM的增生期高于分泌期，正常内膜中无差异，这提示在AM患者中，月经增生期增高的雌激素可增强ANXA2的表达，而正常内膜组中雌激素对其影响较小。因此，降低AM患者雌激素的水平，可以缓解其临床症状。
二、Vimentin与AM
Vimentin主要存在于中胚层起源的细胞中，是间质细胞最重要的中间纤维，并与微管、微丝一同构成细胞骨架，从而维持细胞的完整性[8]。近些年，关于Vimentin与恶性肿瘤的关系，研究重点在于EMT机制。这一概念首次在1982年由Greenburg等[9]提出，是指在某些特殊的生理或病理条件下，上皮细胞失去自身极性，转化为具有活动能力、能在细胞基质间自由移动的间质细胞的过程，包括上皮细胞标志物钙黏附蛋白(E-cadherin)表达减少或消失，同时间质细胞标志物Vimentin出现。1998年Song等[11]发现随着月经周期的变化，Vimentin在AM异位内膜和在位内膜中出现周期性表达，增生期大于分泌期。2010年首次报道出在AM中发生雌激素诱导的EMT机制。分析原因如下：(1)在AM病灶中，E-cadherin表达下降而Vimentin表达上调。(2)血清中雌二醇(E2)的水平与EMT标记物的变化相关。(3)在小鼠实验中，可观察到子宫内膜碎片发生异位从而种植到小鼠腹膜腔，这一现象是通过雌激素依赖性的EMT机制所产生。(4)选择性雌激素受体调节剂(SERM)可抑制雌激素诱导的EMT机制及细胞的侵袭和转移[11]。2012年学者们[6]在关于AM的实验中亦得出雌激素诱导的EMT机制发生于AM。国内已有E-cadherin在AM中的相关报道 ，所得实验结果基本一致，E-cadherin在正常内膜、AM在位内膜及异位内膜中的表达水平呈下降趋势且有差异[12]。但未见Vimentin与AM的相关报道，本实验得出Vimentin在异位内膜中的阳性表达率明显高于在位内膜及正常内膜，在位内膜中的阳性表达率高于正常内膜组，这提示Vimentin在AM的发生发展中扮演着重要角色。与以往文献中关于E-cadherin在AM中的表达情况相结合[12]，判断AM中发生了EMT。而EMT在适宜的微环境下，具有可逆性，即经EMT所形成的间质细胞又可重新转化为具有正常形态和功能的上皮细胞，这一现象称间质-上皮转化(mesenchymal-epithelial transition，MET)[10]，如肝内胆管及上皮细胞的损害不存在后，经特殊治疗，在部分胆管消失的区域又可重新出现具有正常结构和功能的肝内胆管。对于AM患者，这将可能作为一个潜在的治疗目标和新靶点。本研究还发现，Vimentin的阳性表达率在AM的增生期高于分泌期，在正常内膜中无差异，这提示在AM患者中，月经增生期增高的雌激素可增强Vimentin的表达，而正常内膜组中雌激素对其影响较小，这与Song等[11]学者的报道一致。而另有学者认为，Vimentin在AM分泌期的表达高于增生期，这可能和标本差异、月经周期分期及判定结果的标准不同等有关[13]。
三、AM中ANXA2与Vimentin表达的相关性及临床意义
本实验得出ANXA2与Vimentin在AM中的表达呈正相关，提示二者可能协同促进AM发生、发展。ANXA2可通过β-catenin/Tcf信号相关方式，发挥入侵和转移的潜能[6]。而Vimentin标志的EMT机制可由Wnt通路产生，即Wnt与其受体卷曲蛋白(Frz)结合后作用于松散蛋白(Dsh)，抑制β-catenin的降解，从而使其积累于细胞质并进入细胞核与核内Tcf/淋巴样增强因子(Lef)发生作用，下游靶基因被激活，从而诱导EMT过程[14]。因此，有理由推断ANXA2与EMT的标记紧密相关。由此猜测，将ANXA2与EMT的标志物Vimentin及E-cadherin联合起来，可作为监测AM发生发展及判断预后的指标。此外，如何抑制三者在AM中的表达从而达到治疗目的，将有待于进行更深入的研究。
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