脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy，SMA)是一种基因突变导致脊髓前角细胞变性引起肌无力和肌萎缩等临床症状的一组疾病，是一种常见的致死性常染色体隐性遗传病。临床主要表现为肌肉萎缩和肌张力减低进行性加重。1995年运动神经元存活基因(survival motor neuron，SMN)被定为SMA的致病基因，约95%患者存在SMN1第7号外显子的纯合性缺失[1-2]。针对SMA，目前缺乏有效的治疗办法，SMA的产前诊断是有效可行的出生缺陷二级预防办法。在这一诊疗过程中，患者家系的分析及基因检测方法的选择显得尤为重要。现从一个家系的基因分析浅谈SMA的诊断与产前诊断，基因检测方法采用多重依赖性探针扩增法(MPLA)。
对象与方法
1.对象：选取到本院医学遗传中心咨询的曾生育过SMA患儿有产前诊断需求的一个家系作为研究对象。家系中有父亲、母亲、儿子、胎儿。先证者曾在外院经临床诊断与基因诊断证实为SMA，外院基因结果提示为SMN1纯合缺失，已夭折。外院未检出父亲、母亲及儿子的基因携带，仅检测出儿子为SMN2基因纯合缺失。
2.样本采集：父母双方及先证者兄长，用EDTA抗凝管采集静脉血3 ml。胎儿样本采集，超声引导下行羊膜腔穿刺术，抽取羊水15 ml。
3.基因组DNA提取：采用磁珠法提取外周血及羊水基因组DNA。(1)基因检测在进行产前基因分析前，先进行父母双方及先证者兄长的外周血SMN1基因缺失分析。试剂盒采购自荷兰MRC-Holland公司，采用分析血样，P060-B2分析羊水样本。根据说明书进行变性、杂交、连接和PCR反应。PCR产物均在Beckman遗传分析仪上进行毛细管电泳，生成MLPA图谱，Coffalyser生成矩形分析图，比较检测样本与正常对照组的各个外显子信号，以此判断SMN基因外显子的拷贝数。(2)短串联重复序列(STR)检测采用STR检测13、18、21、X、Y的常用位点及方法，排除胎儿常见非整倍体染色体异常的同时进行母血污染鉴定。
结果
将该SMA家系以系谱图呈现(图1)，可以直观观察在家系情况，受检者SMN1与SMN2信号峰值的变化(图2)。与正常人MLPA图谱比较，家系成员中父母及先证者兄长的SMN1外显子7、8产物峰值低于正常峰值。羊水标本即胎儿SMN1外显子7、8产物峰缺如。父母双方及胎儿的SMN2外显子7、8产物低于正常峰值，先证者兄长SMN2外显子7、8产物峰缺如(图2)。
图1 SMA家系图谱
父母及先证者兄长的SMN1外显子7、8的拷贝数均为1，存在杂合缺失，父母双方的SMN2外显子7、8的拷贝数均为1，存在杂合缺失，先证者兄长的SMN2外显子7、8拷贝数为0。胎儿SMN1外显子7、8拷贝数为0，SMN2外显子7、8的拷贝数均为2(表1)。产前诊断结果提示胎儿为SMA患儿，选择终止妊娠。
图2 SMA家系MLPA图谱 A、B分别代表SMN1基因外显子7、8；C、D分别代表SMN2基因外显子7、8
表1SMA家系MLPA检测结果
讨论
脊髓性肌萎缩是一种基因突变导致脊髓前角细胞变性引起肌无力和肌萎缩等临床症状的一组疾病。遗传方式以常染色体隐性遗传为主，也有常染色体显性遗传和X连锁遗传[3-4]的报道。活产儿中发病率约为1/10 000～1/6 000，是第二常见的致死性常染色体隐性遗传病，仅次于囊性纤维化。据报道中国南方SMN1基因携带者发生率为1/80～1/35[5]，与国外学者报道的携带者发生率1/60～1/40[6]相似。其诊断主要通过临床表现、肌电图、肌肉活检以及基因检测。目前缺乏有效的治疗方法。产前诊断是有效预防SMA的二级预防办法。
在SMA患者中最常见的突变是SMN1的纯合缺失，大部分携带者可检测到SMN1其中一个等位基因的缺失，对SMN1外显子7、8进行检测，是SMA基因诊断和产前诊断的首选方法。基因缺失的检测方法包括单肽链构象多态性PCR(PCR-SSCP)、错配PCR-限制性片段多态性(PCR-RFLP)、等位基因特异性PCR(AS-PCR)、变性高效液相色谱(DHPLC)、多重依赖性探针扩增法(MPLA)等。
在众多SMA的分子诊断技术中，PCR-RFLP最常用，也是最初用于确定SMA治病基因的基因检测方法。可根据SMN1和SMN2外显子间碱基差别设计错配引物，并根据特异的酶切位点判定SMN1是否存在纯合缺失。但该方法有一定局限性，无法检出携带者的杂合缺失[7]。该家系的致病基因的检测过程中，外院检测到Ⅱ1的SMN1纯合缺失及Ⅱ2的SMN2纯合缺失，未检测出Ⅰ1、Ⅰ2的基因缺失，原因在于所选择基因检测方法为PCR-RFLP。为避免类似情况发生，本中心在选择基因检测方法时，分析该家系，认为首要考虑的遗传方式应为SMA最常见的遗传方式，常染色体隐性遗传，Ⅰ1与Ⅰ2可能为致病基因的携带者。针对携带者基因检测，与PCR-RFLP相比，MLPA更有优势。
MLPA是2002年荷兰学者Slater等[8]发明的一项基因半定量分析技术，可对致病基因及修饰基因进行定量分析。通过分析，可得到基因拷贝数。陈雅芳等[9]通过比较MLPA与PCR-RFLP两种基因检测方法，MLPA是简便、高校、可靠的基因定量分析技术，在SMA的诊断、携带者筛查及产前诊断工作中是一种有效的基因检测方法。该家系的基因诊断与产前诊断方法均选择MLPA进行。准确检测出家系成员中SMA致病基因的拷贝数，分析出胎儿为SMN1外显子7、8纯合缺失突变携带者，即胎儿为SMA患儿，为胎儿的去留提供依据。依据该产前诊断结果，父母双方选择性终止妊娠，避免了SMA患儿的出生。
刘新秀等[10]对17～20周有SMA生育史的孕妇进行羊膜腔穿刺术，抽取羊水40 ml，进行DNA系列测定后应用PCR-RFLP方法检测SMN1缺失情况，并用STR排除母血污染。本研究的家系分析中，对胎儿进行检测时，采用STR排除母血污染。黄欢等[11]自行研制“HbH-Buffer”，采用对羊水直接扩增和对羊水样本中提取额的基因组DNA扩增进行对照研究发现，结果发现两组扩增效率近似。扩增后通过PCR-RFLP方法进行分析SMN缺失情况。应用羊水细胞直接扩增，可减少检测所需样本量从而降低穿刺相关流产风险，简化步骤，减少污染可能，并可实现快速产前诊断。在SMA的产前诊断中是一种值得推广的技术。
在该家系的产前诊断中，因夫妇双方均为SMN1杂合缺失突变携带者，其后代有1/4机会为SMA患儿，故建议进行产前诊断。在充分告知产前诊断相关风险、检测方法后，选择进行羊膜腔穿刺术，取羊水标本进行致病基因检测，经STR排除母血污染后，最终基因检测结果提示胎儿为SMA患儿，选择性终止妊娠，避免了SMA患儿的出生。
植入前诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)是预防遗传性疾病并可避免流产、引产的一种产前诊断方法。但由于PGD的单个二倍体细胞所能获取到的DNA量有限，导致了包括检出污染率增高、等位基因扩增失败等在内的一系列问题。STR具有可扩增、高度多态性等特点，克服了这些限制。Korzebor等[12]首次报道适于SMA检测的侧翼基因区的5个STR杂合性分析标记(D5S1408，D5S1417，D5S610，D5S637)。这些STR位点符合Hardy温伯格平衡。建议可将类似方法用于其他单基因病的植入前诊断[12]。
2008年美国医学遗传学会(American College of Medical Genetics,ACMG)的指南[13]指出，目前仅有SMA家族史阳性的群体接受了相关基因携带的筛查，推荐应用到更广范围的人群筛查。因其满足进行人群筛查的5大关键因素，即临床表现严重、人群携带率高、有灵敏特异的可靠检测方法、可进行产前诊断和遗传咨询等。国内，有产前诊断资质，有条件开展SMA致病基因筛查及诊断的单位，如能进行人群SMN筛查，针对双方均为携带者的夫妇进行产前诊断，避免SMA患儿的出生，能更有效降低SMA患儿出生率。从而达到降低出生缺陷、提高人口素质的目的。
参考文献
1 Lefebvre S,Burglen L,Reboullet S,et al.Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene.Cell,1995,80:155-165.
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7 张菁菁,罗春玉,刘安,等.应用MLPA技术进行脊髓性肌萎缩症高风险胎儿的产前诊断.现代妇产科进展,2014,26:47-49.
8 Slater HR,Bruno DL,Ren H,et al.Rapid,high throughput prenatal detection of aneuploidy using a novel quantitative method(MPLA).J Med Genet,2003,40:907-912.
9 陈雅芳,何瑾,张奇杰,等.应用多重连接依赖性探针技术进行脊髓性肌萎缩症产前诊断.中国现代神经病杂志,2012,2:294-299.
10 刘新秀,陈万金,叶真,等.超声引导羊膜腔穿刺产前基因诊断脊髓性肌萎缩症.中国产前诊断杂志(电子版),2011,6:13-16.
11 黄欢,王珏,卢守莲,等.羊水直接PCR法快速诊断脊肌萎缩症的实验研究.现代生物医学进展,2013,13:6845-6847,6903.
12 Korzebor A,Derakhshandeh-Peykar P,Meshkani M,et al.Heterozygosity assessment of five STR loci located at 5q13 region for preimplantation genetic diagnosis of spinal muscular atrophy.Mol Biol Rep,2013,40:67-72.
13 Thomas W.Carrier screening for spinal muscular atrophy .ACMG Practice Guidelines,2008,10:1-3.