死亡相关蛋白激酶在肿瘤中的研究进展

死亡相关蛋白激酶(death associated protein kinase 1,DAPK1)是用逆转录法选择用凋亡刺激因素存活的细胞克隆株的方法发现的一个目前已确定的抑癌基因[1]。DAPK1是细胞凋亡的阳性介导因子,DAPK1在IFN-C、Fas、TNF-A[2]和细胞外介质剥离造成的死亡[3]起着调节作用。Kimchi研究小组与日本学者的研究都表明DAPK1在C2-神经酰胺诱导的P12细胞凋亡起着关键作用[4-5]。DAPK1基因在宫颈癌、肝癌、肺癌及膀胱癌和原发性中枢神经系统淋巴瘤组织等多种肿瘤细胞及肿瘤细胞系中失活中表达缺失，主要机制是由于异常的DNA甲基化修饰，从而使抑癌基因表达沉默，促使细胞恶性转化。DAPK1在高分化乳腺癌组织中的表达明显高于低分化鳞状细胞癌中的表达。DAPK1的表达缺失在不同临床分期的精原细胞瘤、非精原细胞瘤性生殖细胞肿瘤向精原细胞瘤的转化和睾丸的恶性转化中具有重要作用。

一、DAPK1的基本结构和功能

DAPK1位于9q34.1[6]染色体的钙调蛋白调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其编码序列全长4 293 bp，其编码的蛋白质分子量约为160 kD，是凋亡的正性调节因子之一[7]，是用基因敲除技术扫描启动细胞凋亡的基因和抑制肿瘤基因时发现的。DAPK1作为DAPK(death-associated protein kinase)基因家族的主要成员,近年来成为肿瘤研究的热点。DAPK1包含7个部分,其中死亡区位于C端,参与由肿瘤坏死因子(NFII)和Fas配体(FasL)所诱导的细胞死亡,在抑制肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。死亡区后是富含丝氨酸的尾部,长度为17个氨基酸残基,可抑制DAPK1诱导的程序性细胞死亡，发挥负反馈调节作用,避免过度的细胞死亡。在已报告的多种原发性恶性肿瘤中,DAPK1基因呈表达缺失或明显的低水平表达。抑癌基因的失活可能涉及多种途径的参与,而与其他抑癌基因不同的是,造成该基因表达异常的原因可能是基因启动子发生了高甲基化。目前普遍认为DNA异常甲基化改变是除缺失与突变之外导致抑癌基因表达抑制的第3种机制[8]。

二、DAPK1与肿瘤的发生

1.DAPK1与细胞凋亡程序：DAPK1广泛表达于人和大鼠的正常组织中[7,9]，在B细胞淋巴瘤、白血病细胞系及来源于膀胱癌、乳腺癌和肾细胞癌的细胞系中DAPK1的mRNA与蛋白表达水平低。DAPK1与肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha TNF-A)诱导的细胞凋亡和锚着非依赖性生长的死亡有关[2-3]，在许多凋亡系统中是一个关键的细胞死亡基因。Lin等[10]研究表明，对侵袭性强的垂体瘤DAPK1的表达失活比率相对于非侵袭性的垂体瘤是明显升高，其失活的机制主要是基因启动子的甲基化和同源缺失。原位末端标记法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)检测转移肿瘤组织切片发现,DAPK1转染的慢生长转移肿瘤的凋亡指数比DAPK1表达阴性组高,提示DAPK1转染表达后对TNF-A或脱离细胞外介质诱导的凋亡十分敏感，而DAPK1的缺陷可以对抗这些诱导凋亡因素的刺激，过表达的DAPK1基因则可直接导致细胞凋亡[2-3],使肿瘤细胞可以锚着-非依赖性地生长,可见DAPK1与肿瘤的侵袭性有着密切关系。

根据DAPK1基因序列合成了一个含17个氨基酸残基的的C-末端多肽段的活性负调控的结构，该多肽可以抑制DAPK1诱导的凋亡[4]，提示DAPK1活性的调控与其自我抑制有关[11]。同时该研究小组也证明了DAPK1活性控制的另一重要机制，即DAPK1的Ser308自我磷酸化。自动磷酸化影响电荷依赖性的CaM调节结构域与催化裂隙的相互作用和ATP的结合位点,同样也使得酶对CaM的结合力下降从而降低DAPK1被CaM激活的易感性。DAPK1去磷酸化可以使DAPK1从这种自我抑制状态解放而行使诱导凋亡的职能[12]。

张海涛等[13]采用RT-PCR技术以K562细胞为实验材料克隆DAPK1基因，为进一步研究DAPK1的功能及基因的表达调控打下基础。Raji细胞的DAPK1基因启动子是完全甲基化的,DAPK1基因在Raji细胞不表达,可被DNA去甲基化药物5-杂氮-脱氧胞苷恢复表达,诱导细胞发生凋亡[14],这为研究DAPK1基因的功能提供了条件。DNA甲基化是最常见的基因转录前调控机制之一,在DNA甲基转移酶催化下,5’CpG中的C连接一个甲基而变成5’mCpG[15]。在真核生物基因组中,多数CG位点均可能发生甲基化修饰,这些甲基化改变主要位于启动子区域的CpG岛。研究表明,DNA甲基化能引起染色质结构,DNA构象、稳定性及其与蛋白质相互作用方式的改变,从而调控基因表达,已经成为表观遗传学调控的最重要修饰机制,在肿瘤、X染色体失活及对环境应激中扮演重要角色[16-17]。

2.DAPK1的表达与肿瘤的生长密切相关：(1)DAPK1的突变与宫颈癌的关系。以往研究表明DAPK1基因在多种肿瘤细胞及细胞系中失活，主要机制是由于异常的DNA甲基化修饰，从而使抑癌基因表达沉默，促使细胞向恶性转化[18-19]。Yang等[20]采用甲基化特异聚合酶链反应(methylation specific polymerase chain reaction，MSP)对85例宫颈癌组织及40例宫颈癌患者的血浆预处理样本，对于DAPK1基因行甲基化分析检测发现，60%组织样本和40%血浆样本发生DAPK1甲基化，异常甲基化宫颈癌组织及血浆中DAPK1表达明显减少甚至缺失，提示DAPK1缺失可能是CIN和宫颈癌发生发展的重要分子生物学基础。(2)DAPK1的突变与内膜癌的关系。首先，相关研究提示DAPK1蛋白在正常子宫内膜、子宫内膜增生症和子宫内膜癌组织中的阳性表达率逐渐下降,说明DAPK1在子宫内膜癌的发生中发挥了一定的作用。其次，DAPK1蛋白的阳性表达率在非雌激素依赖型子宫内膜癌组织中的表达显著低于雌激素依赖型子宫内膜癌组织，提示DAPK1的表达下降可能与细胞低分化和恶化有关,其表达下降可能预示肿瘤的恶性程度和预后不良。(3)DAPK1的突变与胃癌的关系。孔祥勇等[21]检测的66例胃癌组织DAPK1基因启动子的甲基化状态，胃癌组织中66.7%存在DAPK1基因的异常甲基化显著高于相应的癌旁正常组织10.6%，提示肿瘤组织和外周血浆中DAPK1的高甲基化可能为胃癌的诊断及临床预后评估提供有益的线索[22]。体外培养表明，5-氮杂胞苷可以逆转胃癌细胞DAPK1基因启动子甲基化，胃癌细胞生长增殖活性明显被抑制，DAPK1基因的mRNA表达明显增加[23]。胃癌中DAPK1基因处于低表达状态可能与其启动子表观遗传学等改变有关，同时也证明了5-氮杂胞苷能够逆转DAPK1启动子的甲基化。(4)DAPK1突变与乳腺癌。唐纪全等[24]采用甲基化特异性PCR方法结合半定量RT-PCR方法检测了43对人乳腺癌组织和相应癌旁组织中DAPK1启动子甲基化状态结果显示，20例(46.5%)乳腺癌组织DAPK1基因有甲基化，且20例乳腺癌组织中有50% mRNA表达降低或缺失，同时在部分癌旁组织中也发现有DAPK1启动子甲基化的表达，表明乳腺癌中DAPK1启动子甲基化与其转录失活有关,其可能是乳腺癌发生和发展过程中较早期的分子事件。研究DAPK1异常甲基化与乳腺癌的发生、发展的关系有助于调控细胞周期、控制肿瘤转移及阐明乳腺癌形成的原因。(5)李俊华等[25]研究表明,正常健康儿童PBMC的DAPK1基因启动CpG岛CG位点呈无甲基化状态或低甲基化状态,可检测到DAPK1基因mRNA表达,而在白血病细胞株HL-60中呈现高甲基化状态，且对应的DAPK1基因mRNA表达呈缺失状态。Yao等[26]发现DAPK1基因甲基化频率,在加速期和急变期白血病患者中显著高于慢性期患者，且其甲基化程度与患者预后呈负相关，DAPK1基因启动子甲基化修饰完全灭活DAPK1基因mRNA表达。越来越多证据表明,DAPK1基因启动子甲基化是白血病发生过程中的一个重要事件，且随白血病病情发展而显著增高,可作为白血病病情进展及病灶残留监测和患者预后评估分子水平的生物标志物。

3.DAPK1与肿瘤的转移：(1)胃癌的转移。DAPK1与胃癌组织学分级、TNM分期、肿瘤最大径、淋巴结转移及远处转移呈负相关性，提示DAPK1基因表达越低，患者病情越重，预后越差，本文认为DAPK1可作为胃癌初级诊断，病情及预后评估的标志物。(2)乳腺癌的转移。结合临床病理参数统计分析得到DAPK1启动子甲基化与乳腺癌有无淋巴结转移、p53是否阳性有关。p53突变是恶性肿瘤中最为常见的基因异常,DAPK1可能通过下调突变型p53而诱导凋亡,从而发挥抑制乳腺癌的浸润转移作用。(3)肺癌的转移。彭再梅等[27]研究表明DAPK1有抑制肿瘤转移的功能。

三、展望

基因启动子甲基化与肿瘤相关疾病的关系非常密切，由于甲基化是一个可逆的过程，甲基化修复是抑制肿瘤发生、发展的机制之一，可通过一些特殊因素，如甲基化抑制剂逆转DNA甲基化和使沉默基因再活化，恢复肿瘤抑制基因功能，这是治疗癌症的理想方法。临床上现已批准使用的用来治疗癌症的去甲基化的药物有5-氮杂胞苷和5-杂氮-2-脱氧胞苷酸，此外1-(β-呋核亚硝脲)-1，2-双氢奎尼丁也已经证实能使膀胱癌肿瘤体积缩小[28]。目前这些药物已处于临床试验阶段或临床前发展阶段,治疗某些类型肿瘤具有显著效果。目前，去甲基化药物的一个重要的缺点为不能靶向治疗某种特定的基因，只能广泛地去甲基化许多基因，且有些药物因不能口服而导致临床用药受到限制。因此，还需要大量的研究来寻找长期有效的能再活化那些未能正常表达的基因。以后对DAPK1结构功能及其甲基化机制研究的深入和完善，必将对肿瘤的靶向治疗提供更多的选择药物和治疗方式。目前，对肿瘤组织相关抑癌基因异常甲基化谱的检测,有助于对肿瘤的早期诊断,并推动相关肿瘤病因、发生、发展、治疗及预后的研究。

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