出生缺陷(birth defects, BD)是中国严重的公共卫生问题和社会问题[1]，每年新增出生缺陷约90万例[2]。叶酸摄入不足或不能被机体有效利用是导致出生缺陷的主要原因[3]。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(5-methyltetrahydrofolate-homocysteine methyltransferase reductase, MTRR)是参与体内叶酸代谢的关键酶[4]，其基因多态性会影响体内叶酸及同型半胱氨酸水平，与神经管畸形[5]、复发性流产[6]、妊娠期高血压[7]等疾病的发生密切相关，严重影响母婴健康。本研究针对河北省汉族女性，开展大样本的分子流行病学调查，旨在阐明本地区人群的遗传特征，为个体化的孕期保健提供依据。
对象与方法
一、对象
选取2013年6月—2014年8月在河北省廊坊、张家口、承德地区妇幼保健机构进行孕前与孕期检查的汉族女性，排除非本地区籍贯者，各地区分别为4 359例、1 070例和133例，共5 562例，年龄18～40岁，平均(27.73±4.80)岁。患者知情同意，采集口腔黏膜细胞。
二、方法
1.样本采集和处理：利用硅胶吸附方法提取口腔黏膜细胞样本的基因组DNA。采用荧光定量PCR技术，检测MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G的基因多态性。相关仪器、试剂均购自美国ABI公司。每个反应体系10 μl，包括1 μl DNA模板(20 ng/μl)，5 μl Taqman Universal Master Mix，0.5 μl Taqman-MGB探针，3.5 μl去离子水。反应条件为95 ℃预变性10 min，92 ℃变性15 s，60 ℃延伸1 min，20个循环；89 ℃变性15 s，60 ℃延伸90 s，30个循环。反应完成后，在ABI 7900型荧光定量PCR仪上读取样品孔中的终点荧光，利用分析软件确定各个样本的基因分型结果。
2.统计学处理：采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，应用HaploView 4.2软件进行SNPs的Hardy-Weinberg平衡、LD水平和单倍型结构分析。计数资料采用率表示，对基因型及等位基因频率进行χ2检验，检验水准α=0.05。
结 果
一、Hardy-Weinberg平衡分析
对3个地区汉族女性MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因多态性分析，检验结果符合Hardy-Weinberg遗传平衡，说明样本均具有本区域群体代表性。
二、MTHFR、MTRR基因型和等位基因频率在不同地区汉族女性中的比较
河北省汉族女性MTHFR C677、A1298C位点的基因型和等位基因频率全省数据与各地区比较，差异均无统计学意义；与淄博、潍坊、烟台山东省内地区数据比较，与延边、镇江、松滋、德阳、广州、琼海比较，差异均有统计学意义；见表1和表2。677T等位基因频率呈现北方高南方低的趋势、1298C等位基因频率呈现北方低南方高的趋势。MTRR A66G位点的基因型和等位基因频率，河北省汉族女性除了与德阳、广州、琼海汉族女性有差异以外，与其他地区汉族女性比较，差异无统计学意义。
三、MTHFR C677T和A1298C两位点连锁情况及单倍型分析
MTHFR C677T和A1298C两位点组合有9种情况，CC/AA、CC/AC、CC/CC、CT/AA、CT/AC、CT/CC、TT/AA、TT/AC、TT/CC分别为7.2%(402/5 562)、7.4%(411/5 562)、2.0%(111/5 562)、32.3%(1 797/5 562)、16.2%(899/5 562)、0.4‰(2/5 562)、34.8%(1 938/5 562)、0.4‰(2/5 562)、0。单倍型分析表明，存在3种组合，TA(59.1%)、CA(27.1%)、CC(13.8%)。两位点间强连锁不平衡(D’=0.994)，与贵州布依族和苗族人群的报道类似[17]。
讨 论
河北是我国出生缺陷高发省份之一，2001—2012年出生缺陷监测结果显示，出生缺陷总发生率呈逐年上升趋势，先天性心脏病、多指(趾)、总唇裂、总外耳其他畸形、先天性脑积水、神经管畸形是排名前6位的出生缺陷种类[18]。出生缺陷的发生受环境、营养和遗传因素的共同影响。作为参与体内叶酸代谢的关键酶，MTHFR C677T和A1298C位点的多态性会降低酶活性，影响叶酸代谢和利用，与神经管畸形、先天性心脏病、唇腭裂、唐氏综合征等出生缺陷，以及复发性流产、妊娠期高血压等孕期疾病密切相关。C677T和A1298C存在协同作用，导致MTHFR酶活性降低。双杂合子个体与仅含C677T突变的个体相比，同型半胱氨酸浓度显著升高。本研究显示河北省汉族女性这两个位点的双杂合子占16.2%。
河北省汉族女性MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位点多态性与其他地区汉族女性的频率存在差异；MTHFR 677T等位基因频率呈现北方高南方低的趋势，与我国出生缺陷发病率北方高南方低的趋势一致。表明T基因型孕龄女性在低叶酸饮食及未服用叶酸增补剂的情况下，其胎儿唇腭裂的发生风险均会增加，若以上两种情况同时存在，则风险进一步增高。反之，如果能够补服叶酸增补剂、提高饮食中叶酸的含量则可以降低胎儿唇腭裂的发生风险[19]。
表1 不同地区汉族女性MTHFR、MTRR基因型频数和频率比较[例(%)]
注：*该省市MTHFR C677T与河北省比较，P<0.05；△该省市MTHFR A1298C与河北省比较，P<0.05；#该省市MTRR A66G与河北省比较，P<0.05
表2 不同地区汉族女性MTHFR、MTRR等位基因频数和频率分布比较[例(%)]
注：*该省市MTHFR C677T与河北省比较，P<0.05；△该省市MTHFR A1298C与河北省比较，P<0.05；#该省市MTRR A66G与河北省比较，P<0.05
目前的孕期保健措施是从孕前3个月到孕早期3个月，每天增补叶酸0.4 mg[20]。对于那些由于多态性造成叶酸代谢障碍的人群，在补充相同剂量叶酸的情况下，血浆叶酸的浓度较正常人低，同型半胱氨酸水平明显升高。因此，通过对育龄女性进行遗传筛查，针对存在叶酸代谢障碍的遗传风险人群，采取增加营养素补充、加强红细胞叶酸水平监测、提高产前筛查和孕期管理依从性等干预措施，是有效达到出生缺陷及孕期疾病一级预防目的的重要方法，也是提高人口素质的必要手段。
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