过去几十年来，妇女的生殖能力明显下降，部分原因归咎于文化因素，但胎儿和父母的环境污染物暴露也是重要原因之一[1]。2,3,7,8-四氯二苯并对二噁英(2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)是毒性最大、最典型的环境内分泌干扰物，它可通过胎盘屏障和乳汁进入胎儿、婴儿体内[2]，发育中的个体尤其是胚胎对TCDD尤为敏感，对母体几乎不产生毒性作用的低剂量TCDD可毒性影响胚胎，引起子代生长发育缺陷[3-4]。早期卵胞的发生，包括原始卵泡的发育及原始卵泡向初级卵泡的转化，是一切雌性生殖的基础。在此关键窗口期如受到TCDD的影响，可导致成年期甚至是几代间持续的、不可逆转的生殖损害[5-6]。目前，宫内/哺乳期暴露TCDD对雌性后代早期生殖功能影响的研究仍较缺乏。因此，本研究拟通过仔鼠早期卵泡发育的关键时期宫内暴露于TCDD，初步探讨TCDD对新生雌性仔鼠卵巢发育及功能的影响。
对象与方法
一、对象
实验用SPF级别的孕9～11 d SD大鼠购自中山大学医学院实验动物中心，合格证号为0067200。将45只SD孕鼠按每次用药剂量分为空白、玉米油、5 ng/kg、100 ng/kg和500 ng/kg组。母鼠孕13 d(GD13)时用不锈钢灌胃针经口灌胃TCDD，隔天给药一次，共灌喂4次。部分出生后第3天(postnatal day 3，PND3)的雌性仔鼠乙醚麻醉断头处死，分别取材做激素检测、HE染色和电镜切片。空白、玉米油、5 ng/kg、100 ng/kg和500 ng/kg组仔鼠数量为12例。不同处理组间的母鼠基础体重、PND3仔鼠体重和单侧卵巢质量的比较，差异均无统计学意义，见表1。
表1 各组一般资料比较
二、方法
1.仔鼠血清雌二醇和孕酮的测定：由于可采集到的仔鼠血清极少，每只从心脏获取约50～150 μl血清，仅选择测雌二醇(estradiol, E2)和孕酮(progesterone, P)水平。空白、玉米油、5 ng/kg、100 ng/kg和500 ng/kg组采血的仔鼠数量分别为12、11、10、11、9例。采用全自动电化学免疫发光法(The electro-chemiluminescence immunoassay，ECLIA)检测。
2.石蜡切片及HE染色：将卵巢组织切成小块放入FAA固定液中固定。依次用50%→70%→80%→95%浓度乙醇脱水，每个梯度处理2 h，无水乙醇处理1 h(2次)。二甲苯透明处理及浸蜡包埋。将材料固定到切片机上进行切片，厚度约为5 μm。对原始卵泡(primordial follicles)和初级卵泡(primary follicles)计数(采用Olympus CASTGRID系统，利用物理体视框，每张切片选取体视框面积为0.0156 mm2，随即抽取3个视野，根据卵泡形态计数)。参考标准为原始卵泡由初级卵母细胞及其周围的单层扁平颗粒细胞包绕组成；初级卵泡由初级卵母细胞及周围的单层立方形颗粒细胞组成，卵母细胞直径增大。
3.透射电镜观察：卵巢组织块小于1 mm3。经固定和脱水后用纯丙酮+包埋液(2:1)室温3～4 h→纯丙酮+包埋液(1:2)室温过夜→纯包埋液37 ℃ 2～3 h。经固化后用超薄切片机切片，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电镜观察、拍片。
4.统计学处理：用SPSS 13.0数据分析软件包分析。服从正态分布的计量资料以
表示，多样本均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。若方差齐性，采用LSD法进一步行两两比较；若方差不齐，采用Welch法和Dunnett’s T3法行组间两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、PND3雌鼠血清激素水平和卵泡计数
1.PND3雌鼠血清E2水平：各组仔鼠的E2水平比较，差异有统计学意义，100 ng/kg、500 ng/kg组的仔鼠血清E2水平明显下降，与空白组、玉米油组比较，差异均有统计学意义，见表2。
2.PND3雌鼠血清P水平：各组仔鼠的血清P水平比较，差异有统计学意义，500 ng/kg组P水平降低明显，与空白、玉米油和5 ng/kg组比较，差异有统计学意义，见表2。
3.卵泡计数：各组原始卵泡计数比较，差异无统计学意义；500 ng/kg组初级卵泡计数与其他组比较稍下降，但差异无统计学意义，见表2。
表2 各组PND3雌鼠血清激素水平和卵泡计数的比较
注:与空白组比较，*P<0.05；与玉米油组比较，#P<0.05；与5 ng/kg组比较，△P<0.05
二、仔鼠卵巢组织学和电镜观察
空白组为正常原始卵泡结构，卵泡中央为1个初级卵母细胞(图1A1，星)，呈椭圆形、核大而圆、核仁明显、染色质稀疏。周围为颗粒细胞(图1A1，箭)围绕，较小，呈单层扁平状。细胞膜完整，细胞器结构清楚(图1A2，粗黑箭)。
100 ng/kg组见部分卵母细胞胞体增大，胞浆红染或空泡状，细胞核浅染或核溶解消失(图1B1，星)，个别卵母细胞浆浓缩，核固缩深染(图1B1，箭)，颗粒细胞未见异常改变。电镜观察见初级卵母细胞(图1B2，黑箭)不规则，细胞膜不完整，核溶解消失。初级卵母细胞有的线粒体嵴(图1B2，粗黑箭)断裂，不完整或完全消失。
500 ng/kg见卵母细胞核溶解消失，颗粒细胞亦呈固缩变小(图1C1，星)。初级卵母细胞变小，细胞核(图1C2，粗黑箭)固缩，细胞器不清。周围结缔组织结构破坏。
讨 论
本实验结果显示，低剂量的TCDD亚急性宫内暴露并不影响仔鼠的大体发育，然而，500 ng/kg剂量对仔鼠卵巢类固醇(E2和P)分泌明显抑制，差异显著，表明不足以损害仔鼠器官发育的低剂量TCDD宫内暴露可干扰仔鼠的内分泌功能。目前，关于TCDD宫内暴露是否影响仔鼠甾体激素分泌目前尚未定论。多数研究认为TCDD宫内暴露可抑制雌性子代E2的分泌，TCDD具有抗雌激素的作用[7-9]，通过与体内芳香烃受体(AhR)结合[10]，影响卵巢芳香化酶P450表达和酶活性水平，干扰雌激素信号转导，从而导致血中雌激素水平的下降。然而，Pesonen等[11]研究提示，宫内单次暴露2.5 mg/kg后PND14仔鼠的血清黄体酮增加，而FSH和E2均无影响。造成这类研究结果差异的原因可能与TCDD暴露剂量、暴露时机、持续时间以及暴露终点等不同有关。本研究的时间点为仔鼠早期卵泡发育的关键时期(GD13)开始，而不是胚胎着床早期(GD1-4)和器官发育关键时期(GD8)，结果提示低剂量TCDD宫内暴露可能通过干扰仔鼠内分泌途径而损害仔鼠原始卵泡和初级卵泡的发育，这以往未见相关报道。
然而，TCDD宫内暴露是否仅仅通过内分泌干扰途径，而不是通过毒性损害卵泡发育、减少卵巢储备等机制来影响仔鼠生殖功能，以往研究提示TCDD诱导大鼠卵巢颗粒细胞的氧化损伤和细胞凋亡作用明显[12]，TCDD的生殖毒性作用可能与直接对卵巢颗粒细胞的毒性作用，并抑制甾体激素的生物合成以及分泌有关[13]。Fowler等[14]的研究也表明，食用含TCDD的多种混合内分泌干扰物污染的牧草的羊胎儿的卵母细胞数明显较对照组降低，约19%，各级卵泡数也较对照组降低，而且细胞凋亡前蛋白BAX明显增加；TCDD明显干扰胎儿卵巢的发育，如发生在人类，将会导致卵巢早衰的发生。但是，亦有研究认为宫内慢性暴露直至青春期并不降低仔鼠卵巢卵泡大小和数量，仅是血清E2明显降低[8]。造成这类研究结论相悖的原因与TCDD暴露时机不同有关。因此，本实验设计是在仔鼠早期卵泡发育的关键时期(GD13)暴露于不同剂量的TCDD，结果表明各组均未见卵细胞巢结构，各组的原始卵泡计数无差异，说明TCDD在此时间段暴露并不影响卵母细胞巢的裂解，不影响原始卵泡的生成及向初级卵泡转化。然而，仔鼠卵巢HE染色和电镜观察提示宫内暴露100、500 ng/kg TCDD后可见不同程度的病理改变及细胞器破坏，提示此剂量TCDD宫内暴露虽未影响原始、初级卵泡数目，但已损害其细胞器结构和功能，导致内分泌合成途径障碍，降低卵泡质量，进而影响仔鼠后续的生殖功能。
TCDD低剂量宫内暴露(在胎鼠早期卵泡发育的关键时期)病理损害PND3仔鼠卵泡的细胞器、干扰卵巢E2、P的分泌，对子代雌鼠卵巢的发育有毒性作用，可导致雌性仔鼠后续的青春期延迟、性周期紊乱、生殖力下降甚至卵巢早衰等生殖损害。
图1 仔鼠卵巢组织学和电镜观察 A1和A2为空白组；B1和B2为100 ng/kg组；C1和C2为500 ng/kg组
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