卵子玻璃化冷冻与妊娠结局的相关分析

卵母细胞冷冻是辅助生殖领域的研究热点之一，主要冷冻技术包括程序化冷冻及玻璃化冷冻。1999年，Kuleshova等[1]首次采用玻璃化冷冻技术冻存人卵母细胞，并顺利分娩一活胎。近10年来，随着国内开展玻璃化冷冻技术的中心逐渐增多，在不断的实践和改进中发现，玻璃化冷冻的效果不低于程序化冷冻，甚至优于程序化冷冻[2]。玻璃化冷冻是一种快速冷冻技术，简单来说，就是将卵母细胞置于冷冻保护剂中，通过浓度差使细胞脱水平衡后，再放入液氮进行冷冻保存。玻璃化冷冻可使细胞迅速降温，从液态直接变为无结构的玻璃化状态，从而保持溶液状态的分子和离子分布，避免冰晶的形成，减少了细胞的机械性损伤[3]。本中心自2012年开展卵子玻璃化冷冻技术，同年，山西省首例卵子玻璃化冻融行ICSI周期的试管宝宝诞生。卵子玻璃化冷冻为女性患者保存生育力提供了最大希望，也为临床特殊病例如无卵、卵巢功能早衰患者提供了保障。此外，卵子冷冻可以缓解胚胎冷冻面临的伦理、法律、道德、宗教等相关问题，是生殖医学目前研究的热点[4]。由于玻璃化冷冻采用的冷冻保护剂浓度高，一直以来都有对于安全性的顾虑，而且应用于卵子冷冻的时间较短，随访数据较少。本研究对山西省妇幼生殖医学中心2013年1月1日—2013年12月31日共计175例卵子玻璃化冻融后行卵母细胞胞质内单精子注射/新鲜胚胎移植周期分析，探讨卵子玻璃化冷冻与妊娠结局的关系，为提高辅助生殖的活产率提出一些可行性建议。

对象与方法

1.对象：回顾性分析2013年1月1日—2013年12月31日在本中心进行卵子玻璃化冻融后行卵母细胞胞质内单精子注射/新鲜胚胎移植周期治疗患者共175例(冷冻组)，平均年龄(32.2±5.4)岁，不孕年限(4.3±3.3)年。该研究经本院伦理委员会批准，所有患者均签署卵子玻璃化冷冻知情同意书。同时选取2013年本中心进行的新鲜卵子ICSI周期共835例为对照组，平均年龄(31.9±5.3)岁，不孕年限(3.9±3.0)年。不孕原因包括多囊卵巢综合征、输卵管因素、子宫内膜异位症、男方因素以及不明原因的不孕等。两组年龄、不孕年限比较，差异无统计学意义。

2.卵子玻璃化冷冻：冷冻过程在室温下进行，将准备冷冻卵冠丘复合体放入80 U/ml透明质酸酶(vitrolife，瑞典)中消化30 s，用直径为135 μm的剥卵针反复吹吸数次将颗粒细胞脱去，选取MII期的卵子进行冷冻。本实验室所用玻璃化冷冻试剂盒(Kitazato，日本)采用连滴法冷冻，逐渐增加卵子在ES液中的浓度，共计5.4×102 s，观察卵子皱缩后恢复到原来形态，再移入VS液中洗涤60 s，迅速将卵子置于开放式冷冻载杆(cryotop，日本)上，立即投入液氮。

3.复苏程序：卵子复苏冷冻过程在室温下进行，将复苏试剂盒(Kitazato，日本)中TS液升温至37 ℃，从液氮中取出卵子冷冻载杆，前端迅速置于TS液中卵子自动脱落至液体中，平衡60 s后，将卵子依次转移至复苏液DS、WS1、WS2各1.8×102 s，最后将卵子转移至培养皿中，在37 ℃，6%CO2培养箱中培养4 h后行ICSI。

4.激素替代周期内膜准备与胚胎移植：自月经周期第2天开始口服戊酸雌二醇2～4 mg/d，第14天监测血雌二醇(E2)水平和子宫内膜厚度，当E2≥200 pg/ml或内膜厚度达8 mm时开始给予黄体酮，当日复苏冷冻卵子并行ICSI受精，给予黄体酮的第4天行胚胎移植，移植后继续使用黄体酮及戊酸雌二醇。

5.妊娠结局的确定：胚胎移植后12 d测血，对阳性者2周后行B超检查，见宫内孕囊及胎心搏动者为临床妊娠。

6.相关定义：受精率=(受精卵总数/成熟卵总数)×100%；卵裂率=(胚胎总数/受精卵总数)×100%；优质胚胎率=(优质胚胎数/总胚胎数)×100%；临床妊娠率=(临床妊娠总人数/胚胎移植总人数)×100%；流产率=(流产总人数/临床妊娠总人数)×100%

7.统计学处理：本资料分析采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，单因素分析计量资料采用两样本均数t检验，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1.两组妊娠情况比较：冷冻组平均年龄为(32.2±5.4)岁，不孕年限(4.3±3.3)年，受精率为88.7%(831/937)，流产率为13.0%(6/46)；对照组平均年龄(31.9±5.3)岁，不孕年限(3.9±3.0)年，受精率为89.6%(5 433/6 064)，流产率为12.8%(46/360)。两组年龄、不孕年限、受精率、流产率比较，差异无统计学意义。冷冻组卵裂率为93.5%(777/831)，优质胚胎率为33.6%(261/777)，临床妊娠率为26.3% (46/175)；对照组卵裂率为95.6%(5 194/5 433)，优质胚胎率为49.2%(2 555/5 194)，临床妊娠率为43.1%(360/835)；两组卵裂率、优质胚胎率、临床妊娠率比较，差异有统计学意义。

2.冷冻组中持续妊娠和自然流产者比较：持续妊娠者40例，平均年龄(30.5±4.6)岁；自然流产者6例，平均年龄(34.8±4.9)岁；两组年龄比较，差异有统计学意义。持续妊娠者不孕年限为(4.0±3.2)年，受精率为92.3%(275/298)，卵裂率为94.9%(261/275)，优质胚胎率为37.2%(97/261)；自然流产组不孕年限为(4.4±3.5)年，受精率为92.3%(48/52)，卵裂率为95.8%(46/48)，优质胚胎率为37.0%(17/46)；两组不孕年限、受精率、卵裂率、优质胚胎率比较，差异无统计学意义。

讨论

与传统的程序化慢速冷冻相比，玻璃化冷冻明显减少了冰晶的形成，冷冻时间减少，操作简单、经济，显示了极大的优越性。在IVF-ET中，卵子玻璃化冷冻可作为未预期的取精失败，睾丸穿刺未见精子，及其他原因取卵日男方不能到场患者的一种临床补救手段[5]。人成熟卵细胞停留在第2次减数分裂中期，核膜溶解，染色体位于纺锤体上。由于其表面积与体积的比值小，对水渗透性低，易于发生冷冻损伤，尤其是纺锤体对温度特别敏感，且冷冻会使得透明带硬化，影响精子穿透，玻璃化冷冻最大程度上降低了温度对卵子的损伤，提高了卵子冻融存活率[6]。近年来，卵子玻璃化冷冻取得了较好的妊娠结局，但其临床应用国内外报道有限，尚缺大样本的证实。本文中175例患者接受卵子玻璃化冻融后ICSI助孕，平均年龄与本中心同年新鲜卵子行ICSI助孕的患者无差异，去除了年龄因素对妊娠结局的影响。两组卵裂率、优质胚胎率、临床妊娠率有差异，表明玻璃化冷冻同样会对卵子产生不同程度的细胞损伤，主要损伤染色体、纺锤体和透明带，从而影响卵子受精后的正常发育。有研究报道，与新鲜卵子相比，卵子冷冻后mRNA含量会总体下降，玻璃化冷冻会使卵子丢失36.7%的mRNA[7]，这可能就是影响卵子复苏后发育潜能的因素之一。

辅助生殖技术是目前治疗不孕不育症的重要方法，然而辅助生殖妊娠存在较高的自然流产率。来自美国疾病预防控制中心的资料报道辅助生殖妊娠的流产率为16%[8]，流产大多发生于妊娠早期。流产降低了辅助生殖的持续妊娠率及抱婴回家率，并增加患者心理和经济负担。在IVF-ET中，导致自然流产的因素很多，如患者年龄、黄体功能不足、胚胎发育缺陷等[9]。本研究两组流产率无差异，这表明卵子冷冻复苏后不会增加自然流产风险；同时自然流产平均年龄高于持续妊娠，这可能是因为随着女性年龄增加，卵子胞质内过氧化物增多，线粒体数量减少，使得卵子整体质量下降。另外，子宫内膜胶原含量增加，性激素受体减少，降低了子宫内膜对胚胎的容受性。

自然流产作为IVF-ET中主要并发症之一，会加重患者的精神和社会压力。本研究表明，虽然卵子玻璃化冷冻会降低临床妊娠率，但是这种技术不会增加自然流产风险，可作为IVF-ET中取精失败者临床治疗的一个可行的方法。而进一步提高冷冻及复苏效果和降低冷冻保护剂的毒性，减少冷冻带来的损伤，提高临床妊娠率将成为玻璃化冷冻技术发展的方向。

参考文献

1　Kuleshova L,Gianaroli L,Maqli C,et al.Birth following vitrification of a small number of human oocytes case report.Hum Reprod,1999,14:3077-3079.

2　黄国宁,主编.辅助生殖实验室技术.北京:人民卫生出版社,2014:184.

3　Antinori M,Licata E,DaniG,et al.Cryotop vitrification of human oocytes results in high survival rate and healthy deliveries.Reprod Biomed Online,2007,14:72-79.

4　王长华,朱元,伍琼芳,等.卵子玻璃化冷冻技术在IVF—ET中的应用(附7例报告).江西医药,2013,48:405.

5　武学清,毕星宇.卵子玻璃化冻融后行卵母细胞胞质内单精子注射51例的临床结局.中国药物与临床,2014,14: 944.

6　Shi LY,Jin HF,Kim JG,et al.Ultra-structural changes and devel opmental potential of porcine oocytes following vitrification.Anim Reprod Sci,2007,100:128-140.

7　Aluvihare VR,Kallikourdis M,Betz AG.Toleranee,suppression and the fetal allograft.Mol Med,2005,83: 88-96.

8　Farr SL,Schieve LA,Jamieson DJ.Pregnancy loss among pregnancies conceived through assisted reproductive technology United States.Am J EpidemioI,2007,165: 1380-1388．

9　Barbara L,morton BB,Judy E,et al.Female obesity adversely affects assisted reproductive technology(ART) pregnancy and livebirth rates.Hum Reprod,2011,26: 45-252.