多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是育龄妇女常见的内分泌紊乱性疾病，涉及10%～15%的妇女，主要导致月经失调、肥胖、不孕甚至子宫内膜癌[1]。由于该病具有明显的异质性，发病机制尚未阐明。转录因子GATA结合蛋白是一类重要的转录调节因子，其中的GATA-4与卵巢组织中卵泡的发育，颗粒细胞的分化等关系密切。Sander等[2]的研究结果表明，GATA-4的靶基因包括多种卵巢功能基因，如芳香化酶、类固醇激素合成急性调控蛋白等,与PCOS的发病密切相关。复方甘芍贴剂是在传统验方甘芍汤的基础上合理调整，加用透皮吸收辅助药物制成新型中药外用制剂，通过动物实验证实了该药物可纠正多囊卵巢模型大鼠的性激素水平异常，同时经光镜和电镜观察模型大鼠在治疗后卵巢形态学基本恢复正常，包括颗粒细胞层数增加并恢复排卵[3-4]。本研究拟探讨复方甘芍贴剂干预后对多囊卵巢模型大鼠卵巢颗粒细胞GATA-4的表达的影响。
对象与方法
1.对象：6周龄SD雌性大鼠48只，体重范围150～170 g，清洁级，由河北医科大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK(冀)2008-1-003，合格证编号为1109112。
2.主要药物与试剂：(1)药品。复方甘芍贴剂由山西医科大学第二临床医院中药制剂室提供；达英-35(炔雌醇环丙孕酮片)产自拜耳医药保健有限公司广州分公司。来曲唑(芳香化酶抑制剂)产自江苏恒瑞医药股份有限公司。(2)试剂。GATA-4一抗购自美国bioworld公司；聚合HRP标记抗兔IgG(二抗)购自武汉博士德生物工程有限公司。(3)BI-2000医学图像灰度值分析仪产自成都泰门科技有限公司。凝胶扫描采用双色红外荧光扫描成像系统(美国LI-COR公司)。
3.动物模型的建立及分组：6周龄SD雌性有规律的动情周期大鼠完全随机分为正常对照组12只，实验组36只(PCOS模型组12只、达英-35组12只和外用复方甘芍贴剂组12只)。正常对照组灌服1%羧甲基纤维素(CMC)，1 ml/100 g连续灌服21 d[5]。实验组大鼠应用Kafali造模法建立动物模型[3]，三组均灌服来曲唑[1 mg/(kg·d)]溶于1% CMC中，连续灌服21 d[5]。
4.给药：正常对照组和PCOS模型组，自9周龄起灌服1% CMC (1 ml/100 g)，1次/天，共3周；达英-35组为自9周龄起，按人与大鼠公斤体重折算系数给药，将达英-35溶于1% CMC(1 ml/100 g)给药，1次/天，连续3周；复方甘芍外用贴剂组9周龄时，应用脱毛剂对其下腹部进行脱毛，并给予贴剂，1贴/天，并且同期灌服1% CMC(1 ml/100 g)，1次/天，连续3周。处理过程中PCOS组和达英-35组各1只大鼠死亡。到整12周龄时，禁饮食12 h，应用6%水合氯醛(1 ml/100 g)行腹腔内麻醉，取出一侧卵巢后置于福尔马林中固定3 d。另一侧卵巢放于-70 ℃冻存备用作Western blotting检测。
5.标本检测：(1)免疫组化检测。胎盘组织的石蜡切片经常规脱蜡、水化，用3% H2O2处理后，于枸橼酸钠缓冲液中进行抗原修复，加入兔抗人IgG抗体(抗体稀释浓度为1∶50)，37 ℃孵育2 h后，滴加二抗(抗体稀释浓度为1∶50)，37℃孵育30 min，二氨基联苯胺四盐酸(DAB)显色，苏木素复染，常规脱水封片。采用BI-2000医学图像灰度值分析系统进行灰度值测定。切片用图像分析软件提取每张切片的累积光密度值(IOD)，除以切片中有细胞核的区域面积获得该组的每一例研究对象的平均光密度值。(2)免疫印迹法检测。取200 mg胎盘组织，在液氮中碾成粉末，加入7 ml蛋白裂解液，置冰上1 h后，14 000 rpm，15 min，4 ℃，离心，吸取上清液，-20 ℃保存备用。制备8%的SDS-PAGE，蛋白样本与蛋白上样缓冲液混合，100 ℃变性10 min，加样电泳，之后转膜，将PVDF膜置于脱脂奶粉溶液中封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，用TBST溶液洗膜3次，加入二抗室温孵育1 h，在双色红外荧光扫描成像系统(美国LI-COR)下扫描并分析，得到GATA-4的相对表达量。
6.统计学处理：应用SPSS 17.0统计软件进行分析。计量资料用
表示，采用完全随机方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。
结果
1.四组大鼠卵巢组织GATA-4免疫组化阳性结果比较：正常对照组、复方甘芍贴剂组和达英-35治疗组大鼠卵巢组织颗粒细胞核免疫组化检测后GATA-4灰度值低于PCOS模型组，差异有统计学意义；正常对照组、复方甘芍贴剂组和达英-35治疗组两两比较，差异均无统计学意义；见表1和图1。
2.四组大鼠卵巢组织GATA-4蛋白表达比较：经免疫印迹法检测正常对照组、复方甘芍贴剂组和达英-35治疗组大鼠卵巢颗粒细胞GATA-4蛋白表达水平为均低于PCOS模型组，差异有统计学意义；正常对照组、复方甘芍贴剂组和达英-35治疗组两两比较，差异均无统计学意义；见表1。
表1 四组大鼠卵巢组织GATA-4结果比较
注：与PCOS模型组比较，*P<0.05
图1 四组大鼠卵巢组织GATA-4免疫组病理图
A、B为正常对照组(×40，×250)；C、D为PCOS模型组(×40，×250)；E、F为达英-35治疗组(×40，×250)；G、H为复方甘芍贴剂组(×40，×250)
讨论
多囊卵巢综合征是妇科临床常见的高度异质性内分泌紊乱性疾病，由于病因不明，单纯的西医治疗具有疗程长，易复发的特点。传统中医治疗有其独特之处，可以全面调理卵巢内环境起到标本兼治的效果[5]。前期研究发现，复方甘芍贴剂可以逆转多囊卵巢综合征模型大鼠的卵巢形态学异常，并纠正血清性激素异常，但其内在的机制尚不明确[3-4]。本研究结果表明，经复方甘芍贴剂处理后的PCOS模型大鼠颗粒细胞层GATA-4表达明显减少，与目前公认的PCOS治疗药物达英-35取得了类似的治疗效果。
GATA-4基因定位大鼠14号染色体，是一种多功能的转录因子，可以通过激活其目标基因的转录，影响颗粒细胞多肽激素与女性激素的合成，从而间接调节卵泡发育过程。Gillio-Meina等[6]研究结果表明，GATA-4免疫组化检测时主要表达于颗粒细胞核，呈棕黄色颗粒。GATA-4可激活StAR基因，介导胆固醇从线粒体外转移到线粒体内膜，促进孕烯醇酮的合成，与卵泡成熟和凋亡密切相关。Cai等[7]的研究证实，GATA-4主要表达于哺乳动物的卵巢颗粒细胞，与苗勒氏管抑制物质、芳香化酶、类固醇合成急性调节蛋白质或抑制素α等的表达密切相关。GATA-4也参与了CYP19表达的诱导颗粒细胞PGE2的产生调节卵泡的发育。
本研究通过免疫组化检测发现GATA-4的主要表达在大鼠卵巢的颗粒细胞核内。其中PCOS模型组大鼠表现为颗粒细胞核GATA-4表达明显增加。而复方甘芍贴剂干预组和达英-35治疗组均表现为GATA-4表达水平明显减少，和正常对照组无差异。同时采用Western blot方法分析进一步证实GATA-4蛋白的定量表达水平的变化与免疫组化检查的结果一致，提示复方甘芍贴剂可能通过其有效成分刺激卵巢组织颗粒细胞核增加GATA-4蛋白的表达，改善卵巢颗粒细胞产生多肽类和固醇类激素，促进卵巢卵泡组织恢复卵泡发育和排卵功能而发挥治疗作用的。复方甘芍贴剂治疗后PCOS模型大鼠表现在卵巢组织结构和超微结构方面的改变可能是与包括GATA等功能蛋白的表达改变密切相关，为进一步在临床开发利用复方甘芍贴剂治疗多囊卵巢综合征提供理论依据。
参考文献
1 Peigné M,Dewailly D.Long term complications of polycystic ovary syndrome (PCOS).Ann Endocrinol (Paris),2014,22:202-209.
2 Sander VA,Hapon MB,Sícaro L,et al. Alterations of folliculogenesis in women with polycystic ovary syndrome. J Steroid Biochem Mol Biol,2011,124:58-64.
3 王永红,王洪丽,张永洛,等.复方甘芍贴剂对多囊卵巢综合征大鼠模型影响的研究.中国中西医结合杂志,2012,32:394-397.
4 王永红,郝敏,王洪丽,等.复方甘芍贴剂对多囊卵巢综合征大鼠卵巢组织的结构的影响.中国生育健康杂志,2013,3:203-206.
5 王洪丽,王永红.中医药治疗多囊卵巢综合征的研究进展.中国药物与临床,2010,10:1368-1370.
6 Gillio-Meina C,Hui YY,LaVoie HA.GATA-4 and GATA-6 transcription factors: expression,immunohistochemical localization,and possible function in the porcine ovary. Biol Reprod,2003,68:412-422.
7 Cai Z,Kwintkiewicz J,Young ME,et al. Prostaglandin E2 increases cyp19 expression in rat granulosa cells: implication of GATA-4. Mol Cell Endocrinol,2007,263:181-189.