女性生殖障碍包括流产和不孕，自然流产是最常见的生殖障碍之一，发病率占全部妊娠的10%～15%，其中有50%～70%的病例病因不明[1]。研究发现免疫学因素在自然流产的病理过程中发挥重要的作用[2]。层粘连蛋白-1属于黏附分子整合素蛋白家族,为细胞外基质的主要成分,是细胞黏附于基质的重要介质,与其受体结合后直接或间接控制细胞活动,如黏附或转移、极化和分化、增殖或凋亡、基因表达及刺激癌细胞产生胶原酶等,并在滋养细胞的黏附、侵入过程中有重要作用[3-4]。最新研究表明,抗层粘连蛋白-1自身抗体与不孕密切相关[5-6]，但确切的机制不详。本研究通过动物模型的构建探讨抗层粘连蛋白-1(LN-1)抗体与小鼠流产、不孕等生殖障碍的相关性及糖皮质激素对改善抗层粘连蛋白-1抗体阳性小鼠生育状况的作用。
材料与方法
一、实验材料
1.实验动物：19周龄BALB/c小鼠共150只，由北京维通利华实验动物有限公司提供。
2.药物：层粘连蛋白-1(LN-1)由美国sigma公司出产，地塞米松。
3.试 剂：聚丙乙烯板上包被，胎牛血清，辣根过氧化物酶，含双氧水的邻苯二胺，硫酸等。
二、实验方法
1.抗层粘连蛋白-1抗体小鼠模型的构建：将免疫用的LN-1与完全弗氏佐剂乳化；在120只实验雌性小鼠后足真皮内注射15 ug LN-1，作为蛋白免疫小鼠；剩下的30只小鼠作为对照一组，对照一组仅注射单纯完全弗氏佐剂。1周后ELASE法测定小鼠血清抗体滴度值，阳性大于2者为免疫成功小鼠，10只免疫不成功。取实验免疫小鼠45只作为模型组，同时取对照一组小鼠30只，两组小鼠，分别于同种雄性小鼠按1∶1同笼，阴道发现精栓为妊娠第一日。观察两组流产率及产仔数。
2.地塞米松干预研究：取免疫成功的小鼠20只(作为地塞米松组)和免疫成功的小鼠45只(作为对照二组)，于免疫1周后在对照二组和地塞米松组的雌性小鼠同一部位再次注射含15 ug LN-1的完全弗氏佐剂，对照二组注射单纯完全弗氏佐剂。地塞米松组在第6周至交配成功后的10 d里，隔天注射1.5 mg/kg地塞米松。对照二组同法注射等量的生理盐水。
3.生产后3天再次采血，测定抗LN-1抗体，计算各组流产率。
4.应用ELASE方法，测定各组血清抗层粘连蛋白-1抗体。在490 nm处测定光密度(OD值)。分别计算出的平均OD值，得出抗体滴度。
5.统计学处理：采用SPSS 13.0统计软件处理数据，数据以
或百分率表示，计量资料用t检验，计数资料用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
模型组、对照一组和地塞米松组(研究组)三组血清抗层粘连蛋白-1抗体值比较，模型组与地塞米松组差异无统计学意义,模型组与对照一组、地塞米松组与对照一组，差异均有统计学意义。见表1。
对照一组妊娠率90%(27/30)，模型组妊娠率8.9%(4/45)， 对照一组流产率为0，模型组流产率24.4%(11/45)。应用地塞米松组(研究组)妊娠率为20%(4/20)，对照二组妊娠率为8.9%(4/45)，流产率分别为10% (2/20)和33.3%(15/45)，差异具有统计学意义。见表2。
表1三组抗层粘连蛋白-1抗体滴度
注：与对照一组相比，*P<0.05
表2各组小鼠妊娠率及流产率比较[例(%)]
注：*P<0.05
讨 论
女性生殖障碍是目前生殖领域里研究的热点，涉及到多种因素。从生殖免疫观点看来,妊娠是一种成功的半同种移植,妊娠失败、流产可看为移植失败[1]。除常见原因(染色体、解剖、内分泌、感染)之外,原因不明的流产可能与免疫排斥有关。
层粘连蛋白-1是由α1,β1,γ1链组成的异三聚，属于黏附分子整合素蛋白家族，为细胞外基质的主要成分，是细胞黏附于基质的重要介质，与其受体结合后直接或间接控制细胞活动,如黏附或转移、极化和分化、增殖或凋亡、基因表达及刺激癌细胞产生胶原酶等，并在滋养细胞的黏附、侵入过程中有重要作用[6-8]。层粘连蛋白的球状结构可与IV型胶原蛋白结合,非球状结构可通过短臂上P1、E8两个结合位点与细胞结合,起到使细胞与胶原基底粘附的桥梁作用,并促进培养细胞进行有丝分裂。E8能促使细胞扩散, P1酶解片段能作为细胞移动的停止信号,两者相互作用,调节细胞的正常移行和扩散。
动物实验表明，习惯性流产或不孕与自身抗体有关[1]。抗层粘连蛋白-1自身抗体首先发现于有习惯性流产史的猴子血清中。该血清能引起培养的鼠胚胎发育异常[9]。 进一步研究发现，用鼠层粘连蛋白-1或其层粘连蛋白-1残基免疫猴，猴血清会引起胚胎毒性，不孕或习惯性流产[9]。用兔抗层粘连蛋白-1抗体被动免疫妊娠鼠，能引起自发性流产。定位该抗体，发现其位于来自胚胎的Reicher’s膜和卵黄囊内胚层细胞。临床研究显示，习惯性流产患者血清中的IgG层粘连蛋白-1自身抗体明显升高。而且，其增高与其他IgG自身抗体如β2糖蛋白-I (β2GP I)依赖的抗心磷脂抗体( aCL),狼疮抗体(LA),抗DNA抗体，抗核抗体等无关。[6]推测血清中的层粘连蛋白-1自身抗体可能引起人类早孕阶段的习惯性流产[10]。本实验也进一步证实了这一点。
免疫因素导致的生殖障碍，在临床治疗一直是个难点和热点问题。寻找有效的药物治疗靶点，是此类研究的一个瓶颈。本研究提示应用地塞米松不能降低抗层粘连蛋白-1抗体的滴度，但可以改善妊娠结局，其原因可能是应用糖皮质激素治疗能减弱该血清的胚胎毒性并促进早期胚胎发育。糖皮质激素治疗的免疫抑制作用尽管不能减少自身抗体的产生，但可以减轻免疫病理损害，从而有益于层粘连蛋白-1自身抗体阳性患者的受孕及胚胎植入，提高妊娠率。动物实验和临床研究均表明,习惯性流产或不孕与自身抗体有关[1]。抗子宫内膜抗体,β2糖蛋白-I(β2GP I)依赖的抗心磷脂抗体( aCL),狼疮抗体(LA)等自身抗体可能直接导致习惯性流产或不孕,具体机制目前还不清楚[11-13]，推测可能与子宫内膜的抗体沉着及内膜损伤密切相关。糖皮质激素具有良好的细胞膜保护作用，本研究结果显示，尽管应用地塞米松不能降低血清抗层粘连蛋白-1抗体的滴度，但明显提高了妊娠率和降低了流产率。推测糖皮质激素在免疫源性流产和不孕症对提高子宫内膜的容受性具有重要的作用，深入研究可以为改善该类患者的妊娠结局提供理论基础。
稳定的动物模型的构建，是基础医学研究的必要手段。本研究成功地构建了层粘连蛋白-1免疫小鼠模型，研究结果显示该模型具有稳定、可靠的特点，表明该模型具有一定的应用价值。
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