神经管缺陷(neural tube defects, NTDs)是胎儿神经管闭合不全所造成的一类中枢神经系统发育缺陷[1]，是流产、死胎、死产、围生儿死亡的主要原因之一[2]。NTDs的病因和发病机制尚不明确。近年来，研究者通过致畸因素构建NTDs动物模型发现，全反式维甲酸、丙戊酸、环磷酰胺、甲氨蝶呤、高温、孕期高血糖等可引起发育中的动物胚胎出现无脑、露脑、脑膨出、脊柱裂等先天缺陷，且可检测到发生缺陷胚胎的神经嵴细胞凋亡水平升高，提示神经管发育过程中细胞过度凋亡可能是NTDs发生的重要机制[3-7]。但尚未见到应用人类胎儿组织研究NTDs发生过程中细胞凋亡所起的作用的报道。半胱天冬酶(Caspase)家族是细胞凋亡过程中的关键酶，一般以酶原形式存在细胞中，需通过裂解活化才能发挥作用。Caspase家族成员众多，其中Caspase 8/Caspase 9是重要的凋亡启动因子，Caspase 3是最主要的凋亡执行因子。在细胞凋亡过程中Caspase 8、Caspase 9、Caspase 3呈“瀑布式”裂解激活，构成Caspase 8/Caspase 9
Caspase 3级联放大效应，执行细胞凋亡[8]。本研究采用病例对照研究方法，以NTDs胎儿和非缺陷胎儿为研究对象，通过Western blot检测胎儿中枢神经组织内Caspase家族核心成员Caspase 3、Caspase 8及Caspase 9的表达，在分子水平上检测中枢神经组织中细胞凋亡水平，探讨胎儿中枢神经组织中细胞凋亡与NTDs发生的关系。
对象与方法
一、对象
收集2011年6月—2014年12月在山西省昔阳、寿阳等6个县市的多家分娩医院医院产前诊断无脑、脊柱裂或脑膨出而引产或死产，经病理解剖确诊为NTDs的胎儿32例(NTDs组)。收集同期非医学原因引产，经病理解剖未发现先天缺陷、无其他明显异常的胎儿26例(对照组)。采用病例对照研究方法。胎儿母亲均为山西省常住居民(在本地居住2年以上)，且本次妊娠期间在本地居住；汉族；孕周16～38周。由病理科医师按照《病理解剖操作规范》行病理解剖确定有无NTDs及NTDs类型，并在无菌条件下行生物标本采集。通过母亲的面对面调查，收集一般信息及围受孕期(怀孕之前3个月～怀孕后3个月)暴露信息。本研究方案通过北京大学生物医学伦理委员会的审查，研究对象均签署书面知情同意书。
二、方法
1.取材：根据胎儿缺陷类型确定取材组织。取无脑胎儿的残存脑组织、胸腰段脊髓组织；脑膨出胎儿膨出部位脑组织、胸腰段脊髓组织；脊柱裂胎儿脑组织、病变处脊髓组织；对照胎儿的脑组织、胸腰段脊髓组织。NTDs组和对照组脑组织30和20例；NTDs组和对照组脊髓组织23和21例。如果不能及时进行病理取材，将胎儿置-20 ℃冰箱冷冻，然后转移至-80 ℃冰箱中保存。
2.实验试剂：蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒及SDS-PAGE相关试剂(北京普利莱基因技术有限公司)；PBS磷酸盐缓冲液(pH=7.2—7.4，北京中杉金桥生物技术有限公司)；兔Caspase 9、Caspase 8及Caspase 3Ⅰ抗(CST生物公司)、鼠GADPHⅠ抗、山羊抗鼠GADPH辣根过氧化物酶标志IgG Ⅱ抗、山羊抗兔辣根酶标志Ⅱ抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)。
3.实验方法：(1)样本前处理。将脊髓/脑组织标本使用PBS洗去残存血液后，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，4 ℃匀浆提取蛋白质，离心取上清。(2)蛋白质浓度检测。BCA法检测样品蛋白质浓度，计算上样量。(3)Western Blot检测。应用Western Blot检测方法对样本中Caspase 9、Caspase 8和Caspase 3蛋白水平进行检测。将80 μg变性好的蛋白上样，进行12%的琼脂糖凝胶(SDS-PAGE)电泳；蛋白转印装置湿转，350 mA、120 min将蛋白转印到已活化的PVDF膜上；用5%脱脂奶粉将PVDF膜室温封闭2 h后，将相应Ⅰ抗按1∶1 000稀释与PVDF膜结合，4 ℃孵育过夜，之后将PVDF膜用PBST漂洗8次，每次5 min；将PVDF膜用相应1∶4 000稀释的辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗进行孵育，室温1 h，之后将PVDF膜用PBST漂洗8次，每次5 min；将PVDF膜与化学发光剂ECL反应，用Tanon 4500化学发光凝胶图像处理系统检测目标条带。以GADPH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作为内参蛋白。使用Tanon GIS system图像软件进行分析。以同一样本的GADPH的积分光密度值(IOD)作为内参，校正各目的蛋白的IOD，按照公式计算IOD相对值，相对值=目的蛋白IOD/同样本GADPH蛋白IOD。
4.统计学处理：采用SPSS 20.0统计学软件。目的蛋白Caspase 3、Caspase 8和Caspase 9的IOD相对值用
表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、胎儿及其母亲基本信息
两组孕周，母亲的年龄、文化程度、BMI、被动吸烟、孕期高热比例比较，差异无统计学意义，见表1。
表1 两组胎儿及其母亲基本信息
二、Caspase裂解激活水平
脊髓组织和脑组织中有Caspase蛋白原型条带及其裂解活化产物cleaved Caspase条带，NTDs组胎儿中枢神经组织中cleaved Caspase条带较对照组明显，见图1。
图1 Caspase蛋白表达的Western blot实验结果
A、B、C为脊髓组织中Caspase 3、Caspase 8及Caspase 9蛋白及其裂解激活产物；a、b、c为脑组织中Caspase 3、Caspase 8及Caspase 9蛋白及其裂解激活产物。GADPH为内参蛋白
NTDs组脊髓组织和脑组织中cleaved Caspase 3 (17 kD)和cleaved Caspase 8 (18 kD)的表达IOD水平略高于对照组，但差异无统计学意义；两组cleaved Caspase 9 (37/35 kD)比较，差异无统计学意义。无脑胎儿脊髓组织和脑膨出胎儿脑组织中cleaved Caspase 3(17 kD)表达IOD水平高于对照组；无脑胎儿脊髓组织中cleaved Caspase 8 (18 kD)及脊柱裂胎儿脑组织中cleaved Caspase 8 (43/41 kD)表达IOD水平高于对照胎组，差异均具有统计学意义，见表2。
表2 两组不同组织Caspase蛋白表达的IOD相对值
注：与对照组比较，*P<0.05
讨 论
本研究发现，NTDs胎儿中枢神经组织中Caspase的裂解激活产物cleaved Caspase蛋白条带较对照组明显，且在无脑胎儿脊髓组织、脑膨出胎儿脑组织、脊柱裂胎儿脑组织中Caspase 3和Caspase 8蛋白的裂解激活水平高于对照组；两组中枢神经组织Caspase 9的裂解激活水平无差异，提示NTDs细胞凋亡水平高于对照组，且凋亡可能是通过Caspase 8介导的外源性途经(extrinsic pathway)启动。
Caspase 3是Caspase家族中最主要的细胞凋亡执行因子，是细胞凋亡敏感指标，当Caspase 3被裂解激活，细胞凋亡就会不可逆的执行下去[9]。本研究发现在NTDs胎儿脊髓组织和脑组织中cleaved Caspase 3 (17 kD)表达水平略高于对照组，且无脑胎儿脊髓组织和脑膨出胎儿脑组织中cleaved Caspase 3 (17 kD)表达水平高于对照组。这与NTDs动物模型一致[10]。Tung等[10]行丙戊酸(VPA)致小鼠NTDs的模型中，在注射VPA 3～6 h后小鼠胚胎脑部的Caspase 3及其裂解激活产物cleaved Caspase 3表达明显增多；在STZ(链脲霉素)构建的孕期糖尿病小鼠模型[11]或高糖环境下行小鼠胚胎的体外培养[4]均会导致胚胎NTDs高发生率，且在NTDs畸形胚胎中检测到发育中的神经上皮细胞凋亡细胞增多。其他一些利用全反式维甲酸、环磷酰胺、氯乙烯、雷替曲塞等因素构建的NTDs动物模型中也检测到实验组发育中的神经嵴细胞凋亡水平升高[12-15]。据此可推断人胚胎中枢神经组织细胞过度凋亡可能与NTDs发生有关。
根据凋亡信号刺激途径的不同细胞凋亡的发生途径分为外源性凋亡通路和内源性凋亡通路[16]。Caspase 8裂解激活可诱导外源性细胞凋亡途径，Caspase 9则通过裂解激活诱导内源性细胞凋亡途径。对于NTDs发生过程中细胞凋亡的激活途径的探索，之前也有学者进行过相关研究[17-19]，但对于是Caspase 8激活诱导的外源性凋亡途径还是Caspases(18 kD)的表达水平略高于对照组，且无脑胎儿脊髓组织中cleaved Caspase 8 (18 kD)及脊柱裂胎儿脑组织中cleaved Caspase 8 (43/41 kD)表达水平高于对照组；cleaved Caspase 9 (37/35 kD)的表达在NTDs胎儿和对照胎儿中枢神经组织中基本相同；提示Caspase 8诱导的外源性凋亡途径在NTDs发生过程起作用。Zhao等[17]高糖诱导小鼠NTDs实验发现在高糖处理的实验组胚胎神经管中Caspase 8裂解激活片段cleaved Caspase 8水平明显高于对照组；Yang等[18]对4例无脑儿残余脑组织进行蛋白检测发现，其中3例可检测到Caspase 8蛋白的活性裂解片段cleaved Caspase 8，对照组脑组织中未检出，提示Caspase 8介导的外源性细胞凋亡途径在NTDs发生中的重要作用，与本研究结果一致。
本研究提示胚胎中枢神经组织细胞过度凋亡可能与NTDs发生有关，NTDs发生过程中细胞过度凋亡可能是通过Caspase 8介导的外源性凋亡途径。本研究为NTDs发生机制提供了人体来源的证据，为明确人类胚胎NTDs发生的分子机制提供了新的线索。
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