宫内节育器(Intrauterine device，IUD)为中国育龄妇女节育措施的主要方法。第一代宫内节育系统为惰性IUD目前已被淘汰。第二代IUD为活性宫内节育器，长期放置易引起下腹部坠胀，月经过多等。本实验采用本课题组设计的生物可降解纳米载药缓释膜(合成方法和外形设计已取得专利)，利用孕激素(左炔诺孕酮)、低密度聚乙烯材料和纳米离子载药的有机结合，为生物可降解复合材料。纳米载药药量的可控性能够避免放置初期药物的爆释，提高了药物的利用效率。生物可降解复合材料具备良好的组织相容性可以改善子宫内膜对传统IUD的排斥所引起的一系列不适症状，同时材质柔软能够实现宫内放置时间可控，形状可塑，成本廉价，简化了制作工艺，其具有广阔的应用前景[1]。Ishikawa为分化良好的子宫内膜腺癌细胞，具备良好的黏附性能，而绒毛膜癌细胞Bewo侵入能力强。本实验利用Bewo球状体和Ishikawa单层细胞建立的共培养体系作为体外胚胎着床模型，研究左炔诺孕酮纳米载药聚苯乙烯(PS)-聚乳酸(PLA)缓释复合材料对Bewo球状体在Ishikawa细胞单层上黏附和铺展的影响，为聚苯乙烯-聚乳酸可降解材料(空载膜)的生物安全性评价及纳米载药聚苯乙烯-聚乳酸缓释复合材料(载药膜)的安全有效性评价提供实验依据。
对象与方法
一、对象
左炔诺孕酮纳米载药材料的制备：将聚乳酸(PLA)、聚苯乙烯(PS)及载有左炔诺孕酮纳米颗粒的聚苯乙烯(PS)在真空干燥箱，60 ℃的条件下干燥12 h；将45 g聚乳酸(PLA)和5 g聚苯乙烯(PS)或5 g载有左炔诺孕酮纳米颗粒的聚苯乙烯(PS)加入Haake转矩流变仪进行共混，熔融共混温度为180 ℃，时间为8 min；在170 ℃、10 MPa的条件下用平板硫化仪将复合材料压成片材[2]。
二、方法
1.Bewo球的制备：收集处于对数生长期的Bewo细胞，胰酶消化后放入无血清培养基中，每隔4 h吹打一次，培养17～24 h，使其悬浮在培养基中自发形成球状体，依次通过100 μm和70 μm的网筛，筛选出70～100 μm的球状体，与人囊胚直径大小相似。
2.分组：分别剪取30片1 mm×1 mm大小的经过紫外灭菌的聚乳酸-聚苯乙烯生物可降解生物膜(空载膜)和左炔诺孕酮纳米载药聚乳酸-聚苯乙烯缓释生物膜(载药膜)，分别放入500 μl的细胞培养基中缓释24 h制备成缓释液。收集对数生长期的Ishikawa细胞消化后铺于96孔板，待其80%汇合时吸走原培养基，加入空载膜和载药膜缓释液每孔100 μl。吸走作用Ishikawa细胞24 h后的空载膜和载药膜缓释液，加入Bewo球状体每孔30～50个，作为空载膜组和载药膜组，以未加膜缓释液的Ishikawa单层细胞作为空白对照组，观察Bewo球状体在Ishikawa细胞上的黏附率和铺展直径。
3.黏附率和铺展率的测定：Ishikawa细胞和Bewo球状体共培养0.5 h后用PBS洗走未黏附的球状体，计算剩余黏附的球状体数，计算出黏附率(黏附的球状体数/加入的球状体总数)。共培养1 h后在荧光显微镜下测量出每孔球状体的直径。共培养24 h后再次测量球状体的直径，算出每孔球状体的平均铺展直径(μm)为(24 h后的球状体直径/1 h的球状体直径)。每组实验独立重复3次。
4.Ishikawa细胞增殖实验：收集对数生长期Ishikawa细胞，计数后接种到96孔板中(每孔约1 000细胞)，放入37 ℃培养箱中培养4 h后待细胞贴壁后分别加入10 μl的载药膜和空载膜的缓释液，以加入培养基的Ishikawa细胞作为空白对照组，共培养72 h后，每孔加入10 μl CCK8溶液，继续孵育4 h后用酶标仪测定各组细胞在450 nm处的吸光度。每组设3复孔，每组实验独立重复3次。
5.实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR,RT-PCR)：用αv引物进行RT-PCR，反应体系为SYBR Premix Ex Taq 10 μl，cDNA 2 μl，50×ROX Reference Dye 0.4 μl，上游引物0.4 μl，下游引物0.4 μl，DEPC水6.8 μl，共20 μl。反应条件，变性95 ℃ 30 s,延伸95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s共40个循环，溶解曲线分析95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s。读取CT值，以β-actin作为内参，以空白对照组作为基组，利用2-ΔΔCT表示载药膜组和空载膜组相对于空白对照组样本的表达含量。当实验组2-ΔΔCT值<1，表示该组同空白对照组相比表达量降低，当实验组2-ΔΔCT值>1，表示该组同空白对照组相比表达量增加。
6.间接免疫荧光实验：将空载膜组、载药膜组和对照组Ishikawa细胞分别消化后以1×105/ml密度分别铺于24孔板中，待其70%左右汇合后弃去原培养基，PBS洗细胞2次，4%多聚甲醛固定细胞15 min，PBS洗3遍，每次5 min；用0.1% triton X-100对细胞透化15 min，PBS洗3遍，每次5 min；1% BSA室温封闭1 h，PBS洗3遍，每次5 min；加入兔抗人整合素αv一抗(1∶200)，PBST冲洗10 min×3 次。4 ℃孵育过夜，PBST洗3遍，每次5 min；加入FITC标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶200)室温孵育1 h，PBST洗3遍，每次5 min；倒置荧光显微镜下观察各组荧光表达并拍照。根据免疫荧光的强弱程度判断表达水平的改变。
7.统计学处理：采用SPSS 17.0统计软件包进行统计分析，结果以
表示。计数资料采用单因素方差分析、LSD法检验，P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、左炔诺孕酮纳米载药复合材料对Bewo球状体黏附率的影响
空载膜组和载药膜组Ishikawa细胞的增殖率同空白对照组比，差异无统计学意义。载药膜组Bewo球状体黏附率，平均铺展直径和mRNA的相对表达含量与空载膜组和对照组相比，差异有统计学意义；见表1。
表1 左炔诺孕酮纳米载药复合材料对Bewo球状体黏附率，铺展直径及对Ishikawa细胞的增殖和整合素αv的 mRNA表达的影响
注：与对照组比较，*P<0.05；与空载膜组比较，#P<0.05
二、左炔诺孕酮纳米载药复合材料对Ishikawa细胞整合素αv蛋白表达的影响
与对照组比较，空载膜组的Ishikawa细胞整合素αv蛋白表达水平无改变，载药膜组整合素αv 蛋白表达水平明显下降(图1)。
讨 论
聚乳酸是一种新型的生物降解材料，使用可再生的植物资源(如玉米等)所提取的淀粉原料制成，使用后能被自然界中微生物完全降解，最终生成二氧化碳和水，且降解产物能参与人体的新陈代谢，是公认的一种环境友好型材料[3]。与传统塑料相比具有良好的生物降解和组织相容性，因其机械性能和物理性能优良，加工方式多样，且对人体和环境无毒，目前已成为人们研究的热点，但聚乳酸耐热性及抗冲击性差、强疏水性和缺乏反应性基团[4]等缺陷限制了它的进一步发展和更广泛的应用。聚苯乙烯由于其刚性、热性能优良[5]，具备高强度和高模量[6]，易于加工且价格低廉。本课题组通过对聚乳酸与载有左炔诺孕酮纳米颗粒的聚苯乙烯共混改性，显著提高了聚乳酸的热性能，机械性能和生物降解性能[7]。聚苯乙烯-聚乳酸生物可降解材料来源广泛，成本低，制作更加简单，来源于可再生的植物资源，为环保产品，为具备良好的生物相容性，有望取代传统的塑料和金属材料，其有广阔的应用前景和巨大的经济和社会效益[8]。左炔诺孕酮(LNG)为全合成的强效孕激素，有明显的抗雌激素活性，改变宫颈黏液性状能使宫颈黏液变稠阻碍精子穿透，可使子宫内膜上皮细胞呈低柱形使分泌功能受损，促使间质水肿和蜕膜化不利于孕卵着床。本课题组采用纳米技术将左炔诺孕酮药物同高分子材料制成特定的药物输送系统，提高了药物的靶向性和缓释特性[9]，增加药物的吸收，提高了药物的生物利用度[10]，改善了生物膜的通透性[11]，从而提高了药物的稳定性，减少了毒副作用。纳米载药系统已经被广泛应用于医疗领域治疗肿瘤[12]，眼部，中枢神经系统疾患[13]等。本课题组通过将载药纳米颗粒的聚苯乙烯和聚乳酸共混压成片材，实现了形状可塑，以及缓释药量和降解时间的可控性，其良好生物相容性和可降解性避免了子宫内膜对传统宫内节育器排斥所引起的副反应。本研究结果显示，左炔诺孕酮纳米载药缓释复合材料(载药膜)降低了Bewo球在Ishikawa单层细胞上的黏附率和铺展直径，降低了Ishikawa细胞整合素αv的mRNA和蛋白表达，抑制了体外胚胎着床模型的胚胎着床，说明左炔诺孕酮纳米载药聚苯乙烯-聚乳酸复合材料在细胞水平具有安全和有效性。与空白对照组相比，左炔诺孕酮纳米载药聚苯乙烯-聚乳酸缓释复合材料(载药膜)和聚苯乙烯-聚乳酸生物可降解复合材料(空载膜)均不影响Ishikawa细胞的增殖，说明聚苯乙烯-聚乳酸生物可降解复合材料在细胞水平具有生物安全性，本实验研究为左炔诺孕酮纳米载药聚苯乙烯-聚乳酸缓释复合材料作为新型宫内缓释节育材料应用于临床的安全有效性和生物安全性评价提供了实验基础。但这仅是体外模拟胚胎着床模型和从细胞水平对左炔诺孕酮纳米载药聚苯乙烯-聚乳酸缓释复合材料进行生物学评价，若进一步揭示其在分子水平对体液，组织液和对胚胎着床的影响以及纳米载药的长期稳定性，安全性和有效性仍需进一步研究。
图1 左炔诺孕酮纳米载药复合材料对Ishikawa细胞整合素αv蛋白表达的影响(×40) A.空载膜组；B. 对照组；C. 载药膜组
参考文献
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