卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤之一，发病隐匿，致死率高，给广大妇女生命造成严重威胁[1]。大量研究已经证实，卵巢癌细胞的生长、浸润及转移均离不开新生血管和淋巴管的生成，而血管内皮生长因子就是重要的促血管生成因子，具有很强的血管生成和增强血管通透性的作用 [2]。本研究旨在监测不同卵巢组织中VEGF-A，VEGF-C，VEGF-D的表达，分析三者与临床病理特征的相关性，以探讨其在卵巢癌诊断、预后判断及指导治疗中的价值。
对象与方法
一、对象
收集2003—2008年在本院妇科住院经手术治疗并病理学检查确诊的上皮性卵巢肿瘤患者(组织)53例。病理结果包括恶性肿瘤组织37例(恶性组)，其中浆液性囊腺癌23例，黏液性囊腺癌7例，子宫内膜样癌3例，透明细胞癌4例；FIGO分期Ⅰ—Ⅱ期11例，Ⅲ—Ⅳ期26例；恶性肿瘤中高分化者6例，中分化者16例，低分化者15例；有淋巴结转移者22例，无淋巴结转移者15例；患者年龄22～71岁，中位年龄59岁，<50岁11例，≥50岁26例；交界性肿瘤组织9例(交界组)，其中浆液性囊腺瘤5例，黏液性囊腺瘤3例；良性肿瘤组织(良性组)7例。收集同期因子宫腺肌症行子宫及双侧附件全切术的正常卵巢组织8例(正常组)。
二、方法
1.实验方法：肿瘤组织在术后立即用福尔马林固定，随后石蜡包埋，4 μm连续切片。组织切片常规烤片，二甲苯脱蜡，乙醇梯度水化。PBS洗2次，每次各5 min。用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%过氧化氢，室温封闭内源性非特异性过氧化酶5～10 min，蒸馏水洗3次。高温高压修复抗原20 min。PBS洗5 min。滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min，甩去多余液体。滴加一抗(兔抗人VEGF-A多克隆抗体购自上海超研科技技术有限公司，兔抗人VEGF-C、兔抗人VEGF-D多克隆抗体均购自武汉博士德生物技术有限公司)，湿盒中孵育，4 ℃过夜。PBS洗3次，每次2 min。滴加生物素化二抗(山羊抗兔二抗购自武汉博士德生物技术有限公司)，20～37 ℃下静置20 min。PBS洗3次，每次2 min。滴加试剂SABC(武汉博士德生物技术有限公司)，20～37 ℃下静置20 min。PBS洗4次，每次5 min。DAB(武汉博士德生物技术有限公司)显色，显微镜下控制时间。蒸馏水洗，苏木素复染2 min。脱水、二甲苯透明、中性树胶封片、镜检、照相。
2.质量控制：每个染色流程均设对照作为质量控制标准，阳性对照为已知VEGF染色阳性的人大肠癌组织切片，阴性对照采用PBS代替一抗。
3.结果判读：阳性细胞计数方法为恶性肿瘤标本每张切片中选取癌细胞较多的5个高倍视野；交界性肿瘤标本每张切片中选取组织结构紊乱或细胞异型性较大的5个高倍视野；良性肿瘤及正常对照卵巢标本每张切片中随机选择5个高倍视野；每个视野均计数100个细胞，染色结果判断按胞浆内出现特异性染色深浅评分，0分为无色，1分为浅黄色，2分为深黄色至棕黄色，3分为棕褐色甚至更深颜色。再将染色细胞所占百分比评分，1%～10%为1分，11%～50%为2分，>50%为3分。两相乘积即为该例免疫组化得分，0～2分为阴性(-)，3～4分为弱阳性(+)，5～7分为阳性(++)，8～9分为强阳性(+++)。在计算阳性率时，将免疫组化结果判读为弱阳性的标本合并到阴性中计算，结果判读为阳性和强阳性的标本合并到阳性中统计。阳性率=阳性例数×100%/总例数
4.统计学处理：采用统计软件SPSS 12.0统计软件，计数统计资料用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、VEGF-A,C,D在卵巢组织中的表达
卵巢上皮性恶性肿瘤或交界性肿瘤中VEGF-A,VEGF-C,VEGF-D在肿瘤细胞胞浆或胞膜，间质中的血管内皮细胞及部分炎性细胞有表达。良性卵巢肿瘤及正常对照卵巢组织中三者均只表达于血管内皮细胞，但表达强度弱；阴性对照中无染色颗粒。恶性组VEGF-A,C的阳性率高于交界组、良性组和正常组，差异有统计学意义；四组VEGF-D的阳性率差异无统计学意义；见表1。
二、VEGF-A,C,D恶性卵巢上皮性肿瘤中的表达与临床病理的关系
1.VEGF-A阳性表达与临床病例的关系：不同分化程度VEGF-A的阳性率比较，差异有统计学意义，低/中分化VEGF-A的阳性率明显高于高分化；不同FIGO分期VEGF-A的阳性率比较，差异有统计学意义，Ⅲ—Ⅳ期VEGF-A的阳性率高于Ⅰ—Ⅱ期；不同组织学类型、淋巴是否结转移及不同年龄VEGF-A的阳性率比较，差异无统计学意义，见表2。
2.VEGF-C阳性表达与临床病理的关系：不同分化程度VEGF-C阳性率比较，差异有统计学意义，低/中分化阳性率高于高分化；不同FIGO分期VEGF-C阳性率比较，差异有统计学意义，Ⅲ—Ⅳ期阳性率高于Ⅰ—Ⅱ期；是否淋巴结转移的阳性率比较，差异有统计学意义，淋巴结转移组的阳性率高于无淋巴结转移；不同病组织学类型、不同年龄的阳性率比较，差异无统计学意义，见表2。
3.VEGF-D阳性表达与临床病理指标：不同分化程度VEGF-D阳性率比较，差异有统计学意义，低/中分化高于高分化；不同FIGO分期VEGF-D阳性率比较，差异有统计学意义，Ⅲ—Ⅳ期阳性率高于Ⅰ—Ⅱ期；不同组织学类型、是否淋巴结转移及不同年龄VEGF-D的阳性率比较，差异无统计学意义，见表2。
三、VEGF-A，VEGF-C，VEGF-D阳性率的相关性
VEGF-A,C,D的阳性表达率比较，差异无统计学意义，无相关性。
表1 不同VEGF亚型在不同卵巢组织中的表达[例(%)]
注：与恶性组阳性比较，*P<0.05
表2 不同VEGF亚型与临床病理的关系[例(%)]
注：与Ⅰ—Ⅱ级比较，*P<0.05；与低/中分化比较，#P<0.05；与淋巴结转移比较，△P<0.05
讨 论
VEGF是近年来新发现的一种具有多种功能的多肽类细胞因子，是血小板衍生生长因子超家族的重要成员，由多种亚型组成，分子量为34～42 KU。VEGF家族成员与不同的受体结合增加血管的通透性，刺激淋巴管等脉管的形成或生成[3]。VEGF也可直接刺激内皮细胞生长，提高血管的通透性，促进血浆蛋白外渗，有报道在肾癌、膀胱癌、乳腺癌及胃肠道腺癌中VEGF呈高水平表达，在很多正常组织中也呈低水平表达[4] 。血清VEGF水平测定对于卵巢癌的诊断、治疗及预后有着潜在的意义。卵巢肿瘤血管及淋巴管形成相关因子与临床病理方面的研究，国内外少见报道，且由于缺乏足够的证据和大样本的临床试验而未得到充分的验证，结论不一，有待系统性的研究说明。本研究旨在检测不同卵巢组织类型中VEGF的表达及各亚型之间的相互关系，分析三者表达与临床病理特征之间的相关性，从而探讨其在卵巢癌诊断、预后及指导治疗中的作用。
一、VEGF各亚型与不同卵巢组织性质的相关性分析
本研究显示，上皮性恶性肿瘤VEGF-A,C的阳性表达率均高于交界性卵巢肿瘤、良性卵巢肿瘤和正常对照卵巢组织，与Rudlowski等[5]相近。
二、VEGF各亚型与上皮性卵巢癌临床分期和病理分级的相关性分析
VEGF各亚型在卵巢不同类型组织中的表达均与临床分期和病理分级有关，发现VEGF各亚型的表达程度均随卵巢癌临床分期和病理分级增高而增强。因晚期及分化不良肿瘤细胞比早期及分化较好的肿瘤细胞具有更恶性的基因型和表现型，更易促进肿瘤的复发、转移和快速生长[6]，因此卵巢肿瘤内的VEGF表达差异是鉴别肿瘤良恶性的基础。
三、VEGF各亚型与上皮性卵巢癌淋巴结转移的相关性分析
卵巢癌的扩散途径较常见为淋巴结转移，血运转移少见[7]。因此，卵巢癌中淋巴结受累程度也是一项重要的预后指标。对恶性肿瘤中有无淋巴结转移者的VEGF表达分析结果表明，有淋巴结转移者的VEGF-C阳性表达率较无淋巴结转移者明显增高，提示在肿瘤生长过程中，VEGF表达增加，导致血管形成加快，出现大量结构和功能异常的肿瘤血管，促进肿瘤的演进过程，形成转移[8]。其中VEGF-C与肿瘤淋巴转移机制方面的研究较多见。动物实验已经证实[6]，VEGF-C能提高血管通透性，结合并激活VEGFR-3，通过MEK/ERK和PI3-激酶/PKB途径，刺激淋巴管内皮细胞有丝分裂和增生，促进淋巴管生成或血管生成，从而导致肿瘤的淋巴转移[7]，与本研究较为相符。VEGF-D在卵巢癌淋巴转移方面机制的研究鲜见，相关性尚无相关文献报告。有研究发现，在乳腺癌等恶性肿瘤的瘤细胞中VEGF-D表达阳性，可通过结合血管内皮细胞表面受体VEGFR-2及淋巴管内皮细胞表面受体VEGFR-3[8]，具有使血管和淋巴管形成的功能。但本研究与上述发现不一致，可能是因为所研究标本中存在着VEGF的不同表达或检测方法的标准不统一所致。大量试验也已经证实，VEGF-A主要是在肿瘤血管生成方面起主要作用，因此推测可能与淋巴管生成方面关系也不如VEGF-C重要[9-10]。
四、VEGF各亚型与上皮性卵巢癌不同组织学类型、患者年龄的相关性分析
本研究发现VEGF各亚型在卵巢不同组织学类型、不同年龄中的表达均无差异，与Machida等 [11]研究相似。
五、VEGF各亚型在正常对照卵巢组织中的相关性分析
正常对照卵巢的极少部分血管内皮细胞上同样观察到了VEGF的表达，但未发现VEGF强阳性表达，与Gille等[12]研究一致。这可能是由于尽管在正常卵巢中无血管异常增殖，但VEGF在维持原有血管内皮细胞的完整性、血管的密度及维持血管运输营养物质所必需的通透性方面亦有作用[13-14]。
六、VEGF各亚型相关性分析
恶性组中取VEGF各亚型阳性或阴性无差异，故推测亚型间并无特殊相关性及调控通路，VEGF各亚型可能是作为独立因子参与肿瘤的发生、发展，但由于缺乏足够的证据和大样本的临床试验而未得到充分的验证，需进一步深入研究和证实。
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