早产胎膜早破(preterm premature rupture of membranes, PPROM)是指妊娠未满37周胎膜于临产前发生破裂，约30%～40%的早产是由PPROM引发的。PPROM的发病机制尚不明确，目前认为，多因素、多途径、多基因调控所导致的胎膜细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)的降解和胎膜细胞凋亡，最终引起了胎膜破裂。本研究通过分析早产胎膜早破患者胎膜中组织因子(tissue factor，TF)和组织因子途径抑制物-2(tissue factor pathway inhibitor， TFPI-2)的表达，从凝血功能失衡这一新的角度探讨早产胎膜早破的发病机制。
对象与方法
一、对象
选择2012年10月—2013年10月河北省石家庄市第二医院产科剖宫产分娩孕妇共90例。正常晚孕妇女(对照组)30例，足月胎膜早破患者(组)30例，早产胎膜早破患者(组)30例。入选孕妇年龄及孕次匹配，行剖宫产术前均未使用抗生素治疗，体温<37.5 ℃，心率< 100次/分，末梢血白细胞总数<15×109/L，胎心率110～160次/分。所有入选孕妇采集标本及资料均已获知情同意。胎膜早破的诊断标准依据文献[1]：(1)阴道检查见阴道后穹窿有羊水积聚或有羊水自宫口流出；(2)阴道液PH值以石蕊试纸测试阴道液pH值≥6.5时视为阳性；(3)阴道液涂片检查，阴道液干燥片检查见羊齿植物叶状结晶为羊水。
二、方法
1.主要试剂及其来源：试剂一抗为兔抗人TF多克隆抗体及鼠抗人TFPI-2单克隆抗体，均购自美国圣克鲁斯生物技术公司。
2.标本制备：胎盘娩出5 min内取近宫颈处胎膜组织约1.0 cm×1.0 cm大小2块，经生理盐水冲净后置4%多聚甲醛溶液中4 ℃固定24 h，常规石蜡包埋待检测。
3.试验步骤：取标本蜡块厚5 μm连续切片，行PV法免疫组化染色测定。用已知阳性标本做阳性对照，用1%BSA代替一抗做阴性对照。
4.实验结果判定：显微镜下观察切片中滋养细胞免疫染色情况，TF和TFPI-2染色阳性反应为细胞有棕黄色颗粒沉着。根据细胞内染色强度及染色阳性细胞百分率分别进行分级，2项分级数相加，得分0～1分为“-”，2分为“+”，3～4分为“++”，5～6分为“+++”。阳性为+～+++之和。
5.统计学处理：应用SPSS 17.0统计软件进行数据处理。计量资料采用单因素方差分析；病理标本指标比较采用两独立样本的秩和检验，以平均秩次表示，分别与对照组进行两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
早产胎膜早破组较对照组胎膜中TF表达上调(图1、2)，TFPI-2表达下调(图3、4)，差异均有统计学意义；足月胎膜早破组较对照组胎膜中TF表达上调(图5、2)，但差异无统计学意义，TFPI-2表达下调(图6、4)，差异有统计学意义；见表1。
表1 3组TF和TFPI-2的表达情况[例(%)]
注：与对照组比较，*P<0.05
讨 论
胎膜是由羊膜、绒毛膜和其间的细胞外基质组成的。在妊娠过程中，羊膜和绒毛膜中的细胞外基质的相互作用维持了动态平衡，以抵抗来自于胎儿和子宫肌层压力的增长，从而保持了胎膜结构的完整并增强了其抗张强度[2]。当这一平衡状态被破坏时，就容易引起胎膜早破。
本研究采用免疫组织化学法检测主要的促凝物质及其天然抑制剂(组织因子、组织因子途径抑制物-2)在早产胎膜早破和足月胎膜早破患者及正常晚期妊娠孕妇胎膜中的表达。研究结果提示，胎膜中TF和TFPI-2表达水平的变化参与了早产胎膜早破的发病。
在正常妊娠过程中，胎盘滋养细胞以及蜕膜组织可以合成和分泌大量凝血及纤溶因子，用以调节凝血功能的平衡，保护母胎界面。其中，组织因子TF和组织因子途径抑制物TFPI是体内重要的凝血和抗凝血因子。组织因子又称凝血因子Ⅲ或组织凝血活酶，是外源性凝血途径的启动因子。人类子宫蜕膜细胞对组织因子的表达，可以在妊娠的不同时期以及分娩期防止病理性出血的发生[3]。Lockwood等[4]认为在人类足月胎盘组织和子宫蜕膜组织中组织因子的表达超过了母胎界面的其它类型细胞，它定位于细胞膜并与凝血因子VII形成复合物，通过凝血酶生成以满足分娩过程中的止血需求。而组织因子途径抑制物是组织因子的天然抑制剂，对凝血过程有负性调节的作用。生理状态下，二者维持平衡状态。而二者在组织中的表达异常，将会打破这种平衡状态，使病理性凝血酶生成增多，继而发生母胎界面绒毛间隙中凝血功能的异常，对于胚胎的发育及胎盘的形成、局部微循环的通畅、母胎营养交换等方面均造成不良影响并最终导致病理妊娠结局的发生。
Kim等[5]证实早产胎膜早破的发生与胎盘血管的损害有关，其中包括胎盘螺旋动脉重塑的失败、胎盘动脉粥样硬化以及蜕膜的血管病变。这些损害引起胎盘及母体凝血级联反应激活，从而促使凝血酶的生成增多。Chaiworapongsa等[6]及Rosen等[7]也通过实验发现，早产胎膜早破患者较正常妊娠者母体血浆中凝血酶原复合物的浓度升高。另外，母体全身炎症反应应答的增强也将激活外源性凝血途径，使活化的单核细胞表达和释放组织因子TF[8]。Mackenzie等[9]研究发现，胎膜早破患者胎盘和母体凝血系统的激活导致凝血酶生成增加，从而刺激蜕膜细胞分泌基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP),如MMP-1和MMP-3等。基质金属蛋白酶是一组能降解细胞外基质中所有蛋白成分的内源性酶,它可调控细胞外基质的含量和胎膜的结构,基质金属蛋白酶的增多使胎膜中胶原成份过量降解,胎膜强度下降,并引起宫颈软化和扩张,胎膜下垂,羊水压力增大, 最终导致胎膜破裂[10]。Elovitz等[11-12]还发现凝血酶生成的增加还可导致子宫肌层活性的增强，刺激宫缩发动，最终引起分娩的发生。
同时，滋养层细胞还表达组织因子途径抑制物来负性调节组织因子所诱导的凝血过程。TFPI是一种天然的抗凝因子，包括TFPI-1和TFPI-2两种类型。TFPI-1是调节组织因子凝血途径的主要因子，它通过抑制TF-FVⅡa复合物而抑制TF引起的血栓形成。TFPI-2也称为胎盘蛋白-5、细胞基质丝氨酸蛋白酶抑制剂，大量文献证明，TFPI-2可通过抑制包括纤溶酶、胰蛋白酶、基质金属蛋白酶1和3在内的多种蛋白酶活性，在防止细胞外基质降解、维持细胞外基质的稳定中发挥重要的作用[13-15]。因此，TFPI-2在早产胎膜早破患者胎膜中的低表达，削弱了TFPI-2抑制细胞外基质降解的作用，使胎膜结构薄弱，易于破裂。
Erze等[16]通过对209例孕妇(其中早产胎膜早破者123例，正常妊娠者86例)的实验研究发现，早产胎膜早破患者母体血浆中TF浓度较正常孕妇高，而TFPI的浓度较正常孕妇低。这一试验结果进一步证实了早产胎膜早破的发生机制可能与母体内TF/TFPI比例失调，凝血功能失衡有关。
本研究结果也提示，母体内TF/TFPI-2凝血功能失衡可能是早产胎膜早破潜在发病因素之一。一方面，组织因子的增加使凝血酶生成增多，造成胎膜细胞外基质降解酶的增加，加速胎膜细胞外基质的降解，并刺激宫缩发动；另一方面，组织因子途径抑制物-2的减少使其对细胞外基质的保护作用降低，其抑制细胞外基质降解的作用被削弱，这一综合作用促进了早产胎膜早破的发生。随着相关研究的进一步深入，TF/TFPI-2凝血功能的检测可能成为预测早产胎膜早破发病的指标之一。
图1 早产胎膜早破组胎膜中TF(PV染色，×400)
图2 对照组胎膜中TF(PV染色，×400)
图3 早产胎膜早破组胎膜中TFPI-2(PV染色，×400)
图4 对照组胎膜中TFPI-2(PV染色，×400)
图5 足月胎膜早破组胎膜中TF(PV染色，×400)
图6 足月胎膜早破组胎膜中TFPI-2(PV染色，×400)
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