子痫前期（preeclampsia，PE）是妊娠期高血压疾病中较严重的一种，是母儿患病及死亡的主要原因之一。该病的发病机制不明。目前，PE的病因研究主要倾向于胎盘浅着床及内皮细胞的损伤。多种因素导致滋养细胞受累使其浸润力下降，子宫螺旋动脉重铸受阻，胎盘浅着床，使胎盘缺血缺氧，导致胎儿生长发育受限甚至胎死宫内，同时也使胎盘发生氧化应激，发生炎症反应、脂质过氧化，以致胎盘释放多种有毒物质及炎症介质，使血管内皮细胞受损，由于内皮细胞可合成多种生物活性物质，并可调节血管的收缩舒张，最终导致PE及一系列并发症的发生［1-3］。目前分离出PE的致病基因是研究的热点。本研究利用人类基因表达谱Oligo芯片技术，检测PE患者胎盘基因表达的改变，以期找到差异基因与PE可能的相关性。
对象与方法
1.对象：选择2012年1月—2014年1月在本院产科住院的20例PE患者（孕周≥32周）的胎盘组织（PE组）和20例正常妊娠孕妇胎盘组织（对照组）。PE的诊断标准参照谢幸、苟文丽主编的《妇产科学》（第8版）。两组孕妇的年龄、身高、体重、孕次、孕周比较，差异无统计学意义，见表1。两组均无其他合并症，无心血管疾病、肾病、糖尿病、肝脏疾病、血小板较少、甲状腺功能亢进等病史。
表1 两组一般资料比较
2.研究标本的采集：胎盘娩出后，避开钙化点，在胎盘中央迅速切去约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的组织，生理盐水清洗后，放入RNA保存液中，存于-20℃冰箱中。
3.总RNA提取与纯化：从保存的样品中按组各取少量样品混合，加入适量TRIZOL裂解液，按步骤提取出RNA，加入DEPC水溶解沉淀，测定RNA样品浓度和总量，以TE buffer／EB buffer为空白对照和稀释剂时，RNA样品的A260／A280的比值为1.8～2.0，取样品琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的质量并将合格样品保存于-80℃归档。
4.RNA微量扩增：首先是CDNA第一链的合成反应即总 RNA 0.5～2μg加入 T7Oligo（dt）引物1μl，加 Nuclease-free water至 12μl，70℃，5 min变性，在冰上冷却5 min后，加入第一链合成缓冲液2μl、Ribonuclease抑制剂1μl、dNTP 4μl、反转录酶混合液1μl，42℃保温2 h。继续进行第二链的合成，把上述产物置于冰上，得到cDNA样品20μl，加Nuclease-free water 63μl、10×第二链合成缓冲液10μl、dNTPMix 4μl、DNA Polymerase 2μl、RnaseH 1μl，16℃保温2 h，之后按步骤行CDNA的纯化，把所得到的CDNA真空抽干至体积小于8μl，并保存在-20℃。RNA的扩增，将上述得到的CDNA 8μl加入 T7NTP 8 μl、10×Reaction Buffer 2 μl、T7Enzyme Mix 2μl，37℃保温 14 h，之后加入2μl DnaseI，37℃ 30 min消化DNA，之后行aRNA的纯化，将aRNA样品于-80℃，5～20μg进行反转录标记。
5.探针标记：aRNA10μg加入 second round primer 1μl、Spike RNA 2μl、加 Nuclease-free water至10μl，70℃5min变性，然后冰上冷却5min，5×Buffer 4μl、0.1 MDTT 2μl、dNTP mix 1μl、dyedCTP 1μl、Ribonuclease inhibitor1μl、RT 1μl，42℃反应2 h，完毕后2μl0.5MNaOH处理后，然后用将pH调为中性。采用QIAquick PCR Purification Kit纯化产物。
6.芯片杂交：将标记好的探针（Cy3／Cy5）按等量混匀各40 pmol，抽干后，依次加入4×杂交缓冲液7.5μl、甲醛胺15μl加入灭菌水至30μl，离心，95℃水浴5 min，置于冰上1 min，短暂离心，将混合好的探针铺在基因芯片有样品的一侧，然后再放盖玻片，37℃孵箱中16 h。杂交结束后，洗片，气罐吹干至完全干燥。放入扫描片夹中，利用扫描仪（Generation III array scanner，Amersham Pharmacia）进行扫描，将图像转化为基于荧光强度的数字信号（Imagequant5.0；Array Vision 6.0）进行数据分析和处理。通常标准是对照组表达谱（Cy3）和实验组表达谱（Cy5）两个样品信号强度间的差异比值大于2或者小于0.5。
结果
1.总RNA与mRNA的提取结果：总RNA电泳检测28S和18SrRNA条带显示清楚，A260／A280的比值为1.8～2.0，无明显降解，质量可以用来芯片分析。
2.基因芯片的杂交结果：共筛出4 981个在不同样本中检测到的有效信号，存在显著性差异的基因共有95个。与对照组比较，PE组中有19个基因表达下调，76个基因表达上调，上调数多于下调数，除去误差，上述结果反映了样品生物学性质的相似性和差异性。
3.部分表达降低的基因（表2）：与代谢相关基因，CD73、Creatine kinase B、PLCB3、LPL等；与信号转导相关的基因，GNAL、BRAF、HTR1F等；与复制、转录、翻译相关的基因，ZNF536、IGF2BP1等；与免疫相关基因，HAL-G等；与细胞凋亡相关的基因，Bcl-2等。
4.部分表达增高的的基因（表3）：与代谢相关的基因，GPM、Leptin、SELL、Glucose transporter、VF等；与复制、转录、翻译相关的基因，ZNF187、ZNF708、SEPSECS、TBX22、SRFBP1、LHX8等；与信号转导相关基因，GTNXB、OR1D2、INPP5A、RGS12、FCN1等；与免疫相关的基因，IL-1β、TGFBR1、C3AR1、MASP1等。
表2 部分显著表达降低的基因
表3 部分显著表达增高的基因
讨论
基因微阵列技术是一门新兴的技术，具有快速准确高通量的特点，为研究PE的发病机制深入到基因分子水平提供了新的技术平台。本次实验的样本全部选取未临产的孕妇，排除了宫缩后对胎盘的影响，减少争议，同时把20例患者的mRNA混合后一起分析，减少了个体差异，提高实验的可信度。
1.与代谢相关基因表达异常：本研究发现PE患者胎盘中GPM（糖原磷酸化酶）的表达增加，GPM主要与机体的能量代谢密切相关，其主要作用即为分解糖原，GPM表达增加使得糖原的分解代谢加强，持续的糖酵解，需要不断获得丙酮酸［4］。正常的胎盘组织需要能量多，葡萄糖大量消耗，无氧糖酵解成为主要的供能方式。PE患者的胎盘组织缺氧，葡萄糖的供能方式自然受到影响，所以GPM很可能与其发病机制相关［4］。
Leptin（瘦素）表达增加，Leptin可以来源于胎盘，由胎盘滋养细胞合成分泌进入母体的血液循环，也可以来源于脂肪组织的合成分泌。PE患者存在脂肪代谢障碍、糖耐量异常及胰岛素抵抗，这些与肥胖有着共同的病理生理特征。瘦素参与糖、脂肪的能量代谢调节，与肥胖的病生特点一致，考虑PE与瘦素密切相关。患有妊娠高血压疾病的孕妇胎盘分泌瘦素增加，导致血中瘦素水平增高［5］。在缺氧状态下可诱导HIF1（缺氧诱导因子）合成增加，来激活瘦素的启动子，增加瘦素的转录表达［6］。妊娠期高血压疾病时胎盘缺氧，是诱导瘦素合成分泌增加的很重要原因之一。从生理作用上说瘦素增加基础代谢率、增加体温、提高交感神经的兴奋性，与妊娠妇女的高代谢水平相一致。本研究显示，HIF1表达上调，提示PE可能是由于胎盘缺血缺氧激活HIF1，从而增加瘦素的表达，导致高血压。
本研究发现，在PE胎盘中调节脂类代谢的脂蛋白脂酶与glucose transporter（糖代谢相关基因）表达均增高，CD73（核苷酸代谢基因）与能量代谢调节基因B在PE胎盘中表达降低。这些基因表达的改变影响内皮细胞代谢，导致内皮损伤，使得胎盘生长和重铸中发生病理改变。
2.与内皮细胞转导、免疫、凋亡等相关基因表达异常导致内皮细胞损伤：PE的病理特点就是内皮细胞的损伤。内皮细胞表面选择素是中性粒细胞与脐静脉的桥梁，内皮细胞表面的选择素表达增加可增加的中性粒细胞与脐静脉的黏附，会致内皮损伤，从而导致 PE的发生［7］。Nagamatsu等［8］研究发现，NO可以抑制选择素的表达，而PE患者由于NO下降抑制选择素的表达能力降低，出现了选择素的高表达，致使内皮损伤。本研究再次证实了胎盘选择素的高表达，造成血管内皮损伤从而引起PE。
VEGFR（可溶性血管内皮生长因子受体），又称可溶性fms样氨酸激酶1（soluble fms-like tyrosine kinase，sFlt-1），与内皮细胞受损相关。sFlt-1与VEGF及PlGF（胎盘生长因子）结合可抗血管生成同时损伤血管内皮细胞［9］。Wang等［10］体外实验研究发现，在低氧环境中胎盘滋养细胞中sFlt-1表达增加。在PE患者外周血循环中sFlt-1表达增加，抗血管生成作用明显。动物实验中输注sFlt-1可引起大鼠肾小球血管内皮细胞病变与PE患者类似，可见缺氧可刺激胎盘滋养细胞分泌sFlt-1，致血管内皮细胞损伤，在PE的发病中起重要作用。
细胞凋亡表达发生改变，研究表明［11］胎盘缺氧可诱导凋亡抑制基因Bcl-2表达下调而促凋亡基因P53和Bax的表达上调，在本实验中Bcl-2表达下调与上述报告符合。有学者研究［12］发现，在孕早期胎盘细胞凋亡量很小，而随着妊娠的时间增加，胎盘凋亡程度也增加。随着胎盘的老化和分娩，在孕晚期细胞滋养层细胞凋亡增加，但是合体滋养细胞凋亡降低，这可能与Bcl-2的高表达有关［13］。多项实验表明［14］，患有妊娠高血压疾病的孕妇胎盘细胞滋养细胞、合体滋养细胞、蜕膜细胞的凋亡程度均高于正常的妊娠孕妇，这些均表明细胞凋亡参与了PE的发病机制。
与免疫相关基因 HLA-G表达降低，其属于MHC I类分子，主要分布于母胎界面的绒毛外滋养层细胞上，具有调控母体免疫等作用，NK cell是妊娠子宫重要杀伤细胞，HLA-G可抑制其杀伤活性［15］。HLA-G表达降低可使滋养细胞受到母体的免疫攻击，使得胎盘血管重铸障碍，浅着床，参与PE的发病机制。Hara等［16］发现在正常妊娠EVT（绒毛外细胞滋养细胞，extravillous trophoblast）表达HLA-G蛋白，而PE滋养细胞HLA-G的表达欠佳。IL1F10（白细胞介素1家族10）、NCF4（中性粒细胞质因子），MASP1（甘露聚糖结合凝集素丝氨酸肽酶1），表达增高，以上均说明免疫参与PE的发病机制。
基因芯片检测技术的出现，为大规模筛选疾病致病因子提供了很好的工具。本研究通过比较正常胎盘组织和PE患者胎盘组织的基因表达谱，发现了多个与PE病理过程密切相关的基因表达异常，包括细胞代谢、信号转导、细胞凋亡及免疫功能等。此外，还发现一系列未在PE相关生理、病例过程中报道过的异常表达基因，如细胞核内转录因子、腺苷酸环化酶等。本文的研究结果为PE病理机制的研究提供了新的思路，为以后的分子靶基因的治疗提供线索。从PE发病的基因水平去认识了解PE，无论对临床或基础研究均有重大意义。
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