复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指连续3次或以上于20周前发生的自然流产[1]。RSA病因复杂，约50%的RSA病例找不到病因，称为不明原因复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)，与母体对于胎儿的同种免疫异常有关[2]。研究发现URSA患者体内免疫抑制性的调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)比例远低于正常妇女，而促炎性的辅助性T细胞17(T helper cell 17，Th17)比例则高于正常妇女，存在Treg/Th17免疫平衡的紊乱[3]。URSA治疗手段主要为淋巴细胞主动免疫治疗(lymphocyte immunization therapy，LIT)，然而目前其具体作用机制尚不清楚。本研究通过检测外周血Treg、Th17细胞所占淋巴细胞比例及其产物白介素10(interlukin 10，IL-10)、转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、白介素17(interlukin 17，IL-17)含量在LIT治疗前、后的改变，从而提出LIT治疗URSA可能的机制。
对象与方法
一、对象
从2014年6月至2015年5月在深圳市妇幼保健院复发流产中心就诊的妇女中筛选出40例URSA患者入实验组，平均年龄(29.8±4.3)岁，平均流产(3.5±0.7)次。入组标准：(1)连续3次或3次以上自然流产史；(2)年龄小于40岁；(3)夫妻双方无染色体异常；(4)妇检、阴道分泌物、生殖道支原体衣原体、TORCH、B型超声和(或)宫腔镜排除器质性病变、生殖器官解剖畸形及感染因素；(5)性激素、甲状腺功能、血糖、胰岛素等内分泌检查正常；(6)D-二聚体、纤维蛋白原降解产物等血栓前状态相关检查阴性；(7)抗心磷脂抗体、抗核抗体等自身抗体阴性；(8)男方精液常规正常；(9)封闭抗体阴性；(10)既往未进行过主动免疫治疗。
二、方法
1. 治疗方法：研究对象夫妻双方签署淋巴细胞主动免疫治疗知情同意书，丈夫或第三方供血者肝炎病毒、梅毒、艾滋病筛查阴性，且无近期感染迹象。采集研究对象丈夫或第三方供血者静脉血20 ml，加入生理盐水、肝素钠。使用Ficoll密度梯度离心法提取单核及淋巴细胞，使用生理盐水洗涤后约2 ml。使用1 ml注射器于患者的前臂内侧分6～8点进行皮内注射。每次治疗间隔3周，需治疗4次为一个疗程。
2. 标本收集：由深圳市妇幼保健院伦理委员会批准，患者签署知情同意书，所有数据结果均匿名化。分别于治疗前后清晨空腹抽取肝素锂抗凝血4 ml，EDTA抗凝血2 ml。所有EDTA抗凝血液均于2～8℃ 1 000 xg离心15 min后收集血清放入-80℃冰箱保存待测。
3. 实验方法：采用CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE标记细胞膜表面抗原，CD4-FITC、IgG2a-PC5、IgG1 Mouse-PE作为同型对照，检测CD4+CD25+CD127lowTreg细胞；使用PMA Ionomycin BFA Monensin mixture(250X)和RPMI 1640淋巴细胞培养液进行全血细胞刺激培养后， PerFix-nc破膜，CD8-FITC、CD3-PC5、anti-human IL-17A PE标记细胞膜表面抗原，CD8-FITC、CD3-PC5、Mouse IgG1 K Isotype Control-PE作为同型对照，检测CD8-CD3+IL-17A+Th17细胞。以上试剂均购自美国Beckman Coulter公司。ELISA试剂盒为进口分装，购自上海邦奕生物科技有限公司，所有操作按试剂盒说明书进行。
4. 统计学处理：采用SPSS 19.0软件统计分析数据，检查方差齐性后对LIT治疗前、后的结果进行配对t检验。再将流式细胞学检测、ELISA结果进行Pearson相关性分析。所有P值基于双侧检验，统计学显著水平为P<0.05。
结 果
一、流式细胞学检测结果比较
40例URSA患者LIT外周血CD4+CD25+Treg细胞、CD4+CD25+CD127lowTreg细胞和CD8-CD3+IL-17A+Th17细胞所占淋巴细胞比例治疗前、后比较，差异有统计学意义；治疗前、后的CD4+CD25+Treg/CD8-CD3+IL-17A+Th17比值有差异，差异有统计学意义。见表1。
表1 外周血Treg细胞、Th17细胞流式细胞学检测结果
注：治疗前后比较，*P<0.05
经LIT治疗后40例URSA患者外周血CD4+CD25+Treg细胞、CD4+CD25+CD127lowTreg细胞均与CD8-CD3+IL-17A+ Th17细胞所占比例的变化呈负相关(r=-0.724，P<0.01；r=-0.571，P<0.01)。
二、ELISA检测结果比较
40例URSA患者LIT治疗前、后血清IL-10、TGF-β1、IL-17水平比较，差异均有统计学意义。见表2。
表2 ELISA检测血清TGF-β1、IL-10、IL-17结果
注：治疗前后比较，*P<0.05
三、各细胞因子与细胞所占比例变化的相关性
40例URSA患者LIT治疗后外周血Th17细胞所占比例的改变与血清IL-17水平的改变呈正相关(r=0.693，P<0.01)；外周血CD4+CD25+Treg细胞所占比例的改变与血清TGF-β1水平的改变呈正相关(r=0.658，P<0.01)；外周血CD4+CD25+Treg细胞所占比例的改变与血清IL-10水平的改变呈正相关(r=0.654，P<0.01)。
讨 论
URSA是近年来生殖医学领域最大的难题之一。研究证实，URSA患者体内存在人类白细胞抗原相容性异常、自然杀伤细胞数量及功能异常、T细胞亚群失衡等免疫平衡紊乱[4-5]。虽然胎儿的父系抗原被母体免疫系统认为是异体，但胎儿一般可于整个妊娠周期存活在母体子宫中，而保护胎儿躲避母体免疫系统的机制尚未完全清楚。LIT治疗是目前URSA主要的治疗手段之一，其具体机制不明。随着生殖免疫学的进展，对Treg细胞和Th17细胞的认识逐渐加深，越来越多的学者认为URSA病人体内存在Treg/Th17免疫平衡紊乱[6]。
目前，LIT治疗是URSA最常用的治疗方法，许多研究均表明LIT可改善妊娠结局[7]，虽然一些meta分析的结果认为LIT无效[8]，但由于存在实验室质控以及人群差异性，仍不能下此结论。从世界范围的meta分析和研究结果来看，LIT治疗对一部分人群有很好的疗效[9]。林其德教授的团队报道显示LIT治疗URSA患者的有效率可达87%，并且采用丈夫供血的疗效与第三方供血的疗效差异无统计学意义[10]。在本研究中， 40例URSA病人LIT治疗后外周血中的Th17细胞所占淋巴细胞比例显著降低，Treg细胞所占淋巴细胞比例显著升高，Treg/Th17比例也显著升高。在后续的随访中，有17例URSA患者已经妊娠，其中1例妊娠16周因“胎儿复杂性心脏病”引产,1例生化妊娠；其中7例妊娠未满12周；另8例妊娠超过12周，NT值均正常。这些免疫治疗后妊娠成功的病例也说明了LIT治疗可改善随后的妊娠结局。虽然现在普遍认为LIT治疗有一定的疗效，但其具体的作用机制一直还未明确。
CD4+CD25+T调节细胞是T细胞一个非常重要的亚群。本研究发现在使用LIT治疗URSA患者后可刺激机体调节性T细胞比例升高。将LIT治疗前、后的URSA患者外周血CD4+CD25+Treg细胞所占淋巴细胞的比例进行配对t检验，结果显示LIT治疗后外周血CD4+CD25+Treg细胞所占比例显著升高。叉头框螺旋转录因子(Foxp3)是一种核内蛋白转录因子，Foxp3阳性的CD4+CD25+Treg细胞可通过细胞直接接触的方式抑制免疫反应[11]，然而检测Foxp3需对细胞进行破坏，不利于后续的研究与应用。文献报道CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞同时低度表达CD127 [12]。因此本研究采用CD127标记Foxp3+Treg细胞，将LIT治疗前、后的URSA患者外周血CD4+CD25+CD127low Treg细胞所占淋巴细胞的比例进行配对t检验，结果显示LIT治疗后外周血CD4+CD25+CD127lowTreg细胞所占比例显著升高。在外周血中，IL-10、TGF-β可诱导CD4+CD25+ Treg细胞的产生，并分泌IL-10、TGF-β进行免疫抑制[13-14]。本研究发现LIT治疗后血清TGF-β1、IL-10水平、外周血CD4+CD25+Treg细胞和CD4+CD25+ CD127lowTreg细胞所占淋巴细胞比例均升高，且IL-10、TGF-β1水平的升高与CD4+CD25+Treg细胞所占比例的增加呈正相关。据此可推测LIT治疗可影响URSA患者体内Treg细胞的数量及功能。
此前有报道显示TGF-β水平减低可能导致Treg细胞减少和Th17细胞增加[15]。在本研究中，40例研究对象LIT治疗后血清中与Th17细胞相关的细胞因子IL-17的水平显著降低；而与Treg细胞相关的细胞因子TGF-β1、IL-10则显著升高。因此，Treg细胞可能通过分泌具有免疫抑制作用的细胞因子TGF-β1、IL-10来发挥作用。另外，有研究表明高水平的TGF-β可诱导分化CD4+CD25+Treg细胞，并增加Foxp3的表达[16]，这与本研究结果一致。由于CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞同时低度表达CD127，因此本研究对CD4+CD25+CD127lowTreg细胞进行检测，结果发现治疗后血清TGF-β1、IL-10水平、外周血CD4+CD25+Treg细胞和CD4+ CD25+CD127lowTreg细胞所占淋巴细胞比例均显著升高，且IL-10、TGF-β1水平的升高与CD4+CD25+Treg细胞所占比例的增加呈正相关，而外周血CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+CD127lowTreg细胞所占淋巴细胞比例的增加均与CD8-CD3+ IL-17A+ Th17细胞所占比例的改变呈负相关。Th17细胞产生IL-17，在炎症的介导中有重要作用[17]。相反，Treg细胞在免疫调节及介导免疫耐受中起主要作用[18]。研究发现URSA患者外周血的Th17细胞比例较高[19]，提示了Th17细胞在妊娠的维持中可能起到了不良的作用。有文献报道Foxp3+的Treg细胞通过TGF-β对IL-6介导的Th17细胞形成有抵抗作用[20]。在本研究中LIT治疗后外周血CD4+CD25+Treg与CD4+CD25+CD127lowTreg细胞所占淋巴细胞比例的增加均与CD8-CD3+ IL-17A+ Th17细胞所占比例的改变呈负相关。因此，LIT可能可以通过影响URSA患者体内Treg细胞的数量及功能，改变Th17细胞的形成条件并抑制其功能，从而减少Th17细胞及IL-17的产生。
以上结果均表明LIT可能通过影响URSA病人的Treg/Th17免疫平衡来发挥作用，而Treg细胞亚群的数量、功能的提高和Th17细胞亚群的数量、功能的降低可能对妊娠结局有好处。据此，Treg/Th17免疫平衡可能是URSA患者免疫治疗的新靶点。本研究不足之处在于样本量较小，后续仍需要扩大样本量进一步研究，并继续随访研究对象的妊娠结局。
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