玻璃化冷冻由于温度快速下降，避免了细胞内外冰晶形成，减少一系列物理及化学损伤，能有效提高冻融后胚胎的存活率，近年来在临床中被广泛使用。但玻璃化冻融的安全性也值得研究。玻璃化冻融需将胚胎暴露于高浓度的冷冻保护剂中，增加了冷冻保护剂的毒性作用和渗透性休克对胚胎的影响[1]。不同的胚胎对冷冻保护剂的耐受性存在个体差异，这种差异具体表现为不同胚胎在玻璃化冷冻液中恢复时间的不同；以及胚胎冻融后，有的胚胎发生了卵裂球融解；有的胚胎虽然解冻当时没有发生卵裂球融解，但随着继续培养，有进一步发生卵裂球融解的可能[2]。因此，玻璃化冻融对不同胚胎的影响仍被众多学者关注。胞浆中央颗粒化(centrally located granular cytoplasm，CLGC)是一种常见的卵母细胞胞浆形态异常，它表现为卵细胞胞浆中央变黑、粗糙、局部颗粒增粗，与周围正常的胞浆有较明显分界。有报道称由CLGC卵发育的胚胎多为Ⅱ级、Ⅲ级胚[3]。那么，玻璃化冻融对CLGC来源的胚胎的损害是否会进一步加重，进而影响临床妊娠结局？基于以上问题，本研究对玻璃化冻融对CLGC来源的胚胎发育潜能的影响进行了探讨。
对象与方法
1.对象：2012年7月—2014年7月在湖北省荆州市中心医院生殖中心行卵胞浆内单精子显微注射-胚胎移植(ICSI-ET)治疗且获卵均为CLGC卵的106周期。其中研究组58周期，D3胚胎行玻璃化全胚冷冻，三个月后行玻璃化解冻胚胎移植。对照组48周期，D3胚胎行新鲜胚胎移植。两组患者经临床检查证实，不孕原因主要为输卵管盆腔因素、多囊卵巢综合症、男性少弱精症或无精子症。
2.超促排卵方法：根据患者卵巢储备能力，即月经第3天窦卵泡数、基础内分泌及年龄选择降调节方案。长方案于启动前一周期黄体中期开始使用短效促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a，达必佳，德国辉凌)0.05 mg/d，1周后经阴道B超复查，如出现生理性囊肿，则立即在阴道B超引导下穿刺引流。依据垂体降调节情况和卵巢储备能力，自月经第3～6天开始注射促性腺激素(Gn，Gonal-F,Serono瑞士)225～300 u/d，根据阴道B超监测卵泡生长情况并随时调整Gn剂量，当至少一个卵泡直径≥18 mm时注射hCG(丽珠制药)10 000 IU，36 h后经阴道B超指引下取卵。短方案于月经第2天采用GnRH-a，第3天注射Gn。
3.卵母细胞、卵裂期胚胎评估及全胚玻璃化冷冻标准：取卵后1 h(D0)行透明质酸酶脱颗粒细胞，4～6 h行ICSI,在配备有Hoffman调制相差系统和恒温热台的倒置显微镜(Nikon，×200倍)下记录卵母细胞的形态学特征，区分CLGC卵及卵胞浆形态正常卵。 ICSI后16～20 h(D1)观察原核形态，看到双原核即为正常受精，于受精后42～44 h(D2)、受精后66～68 h(D3)评估卵裂期胚胎形态，记录胚胎的卵裂球数、卵裂球的均一程度、胚胎碎片数量与分布、胚胎的色泽与胞浆形态、单个卵裂球中是否存在多核情况。根据形态学特征，将早期胚胎分为4级[4]。Ⅰ级、Ⅱ级胚胎为优质胚胎，Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级胚胎为可利用胚胎，可供移植或冷冻。
全胚玻璃化冷冻标准：hCG注射日抽血检查孕酮值较高(P>3.82 nmol/L)、卵巢过度刺激综合征、移植日高烧等不能进行鲜胚移植的情况，D3行全胚玻璃化冷冻。3个月后解冻胚胎移植。
4.玻璃化法：(1)玻璃化冷冻。采用JY VITRIFICATION MEDIUM(加拿大JY公司)冷冻试剂，冷冻试剂批号为JY-V111301。冷冻液分为V1(Equilibration solution)和V2(Vitrification solution),2℃～8℃低温保存，使用前从冰箱取出，放置在室温24℃复温平衡至少30 min后使用。用标记笔把一个3002皿底分成二半，标上V1、V2。分别用二支玻璃吸管吸取V1和V2，各做成四个小滴(液滴体积为25～30 ul)，用剥卵针将胚胎置于V1液滴表面5 min，并经过四个液滴中转移洗涤后室温下放置，胚胎自然下沉，出现皱缩再回复，当胚胎膨大到至少80%以上时，迅速用剥卵针将胚胎放入V2中，在V2中经过四个液滴转移洗涤，将胚胎转移至玻璃化冷冻载杆(加拿大JY公司)叶片上，液滴体积一般为1.0～1.5 ul,时间不超过2 min。将玻璃化冷冻载杆迅速置入液氮中，旋转5次后放入冷冻铝支架内，转移到液氮罐中标记保存。(2)玻璃化解冻。采用JY THAWING MEDIUM(加拿大JY公司)解冻试剂，解冻试剂批号为JY-T041305，解冻液为T1(Thawing solution)、T2(Dilution-1 solution)、T3(Dilution-2 solution)、T4(Washing solution)。2℃～8℃低温保存，使用前从低温冰箱取出，放置在室温24℃复温平衡30 min后使用。用标记笔把一个3002皿底分成四份，标上T1、T2、T3、T4。分别用四支巴氏吸管分别吸取T1、T2、T3、T4，各做成四个小滴(液滴体积为25～30 ul)，并用5 ml移液管吸取6.75 ml平衡好的矿物油覆盖。并准备一个3037双井皿，放入100 ul的T1。将玻璃化冷冻载杆从液氮中取出，迅速将前端叶片浸入3037皿T1中，1 min内将胚胎用拉制好的巴氏毛细吸管从T1中转到T2中，并经过四个液滴中转移洗涤后室温下放置3 min，胚胎将上浮到液滴表面。3 min后将胚胎从T2中转到T3中，并经过四个液滴中转移洗涤后室温下放置3 min，胚胎自然下沉。3 min后将胚胎转到T4中，并更换巴氏毛细吸管，经过四个液滴中转移洗涤后37℃下放置3 min。胚胎形态将完全恢复，然后将胚胎转入囊胚培养液中，放入COOK三气培养箱中培养至少2 h，等待移植。
5.复苏后胚胎评估：在配备有Hoffman调制相差系统和恒温热台的倒置显微镜(Nikon，×200倍)下记录胚胎复苏后的形态学特征，记录胚胎的退化情况、卵裂球受损数、卵裂球的均一程度、胚胎碎片数量与分布、胚胎的色泽与胞浆形态等。
6.冻融胚胎移植周期患者内膜准备方案：(1)自然周期。月经周期规律、排卵正常且子宫内膜生长良好的患者在月经第11天左右开始经阴道B超监测子宫内膜及卵泡发育情况，并结合血雌激素(E2)、黄体生成素(LH)测定，评估卵泡及内膜发育情况，确定排卵时间，排卵后黄体酮60 mg/d肌肉注射连续3 d且子宫内膜厚度≥8 mm,第3天上午行融胚移植。(2)替代周期。有排卵障碍、月经不规律或自然周期内膜发育欠佳的患者在月经第3天起开始口服戊酸雌二醇(补佳乐，德国先灵公司)2～4 mg/d，4 d后经阴道B超监测子宫内膜厚度及血E2水平，根据子宫内膜形态、厚度调整补佳乐药量，内膜生长不理想者可加量至6～8 mg/d，当子宫内膜厚度≥8 mm，加用孕激素(黄体酮)60 mg/d，肌肉注射，第3天上午行融胚移植。
7.胚胎移植及妊娠的确定：hCG注射日抽血检查，若孕酮 (P<3.82 nmol/L)，D3上午行新鲜胚胎移植。按卫生部176号文件规定的新鲜胚胎移植策略,每周期移植胚胎总数不得超过3个，其中35岁以下妇女第一次助孕周期移植胚胎数不得超过2个；优先选择原核评分好，第二天、第三天胚胎发育正常评分好的胚胎，如单原核发育的胚胎，在无双原核优质胚胎的情况下，也可移植。 冻融胚胎复苏2 h后移植。移植后2周抽血查β-hCG,若升高(β-hCG>10 U/L)，为生化妊娠，移植后4周B超检查，以B超检查见到宫腔内妊娠囊为临床妊娠。
8.观察指标：(1)胚胎复苏存活率=(存活胚胎数/解冻胚胎总数)×100%，解冻后完好卵裂球数目大于50%为复苏存活胚胎；(2)周期取消率=(取消移植的周期/解冻周期)×100%；(3)完整胚胎率=(解冻后卵裂球完整存活的胚胎数/解冻胚胎总数)×100%；(4)解冻后胚胎卵裂球部分退化率=(解冻后卵裂球部分损伤的胚胎数/解冻胚胎总数)×100%，解冻后损伤卵裂球数目在一个至一半之间为解冻后部分卵裂球退化胚胎；(5)临床妊娠率=(临床妊娠数/移植周期数)×100%；(6)种植率=(宫内孕囊数/移植胚胎数)×100%；(7)流产率=(流产数/临床妊娠数)×100%。
9.统计学处理：采用SPSS 17.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差或 % 表示，组间比较主要采用t检验或χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1.患者的一般情况：研究组原发不孕37例，继发不孕21例；对照组原发不孕26例，继发不孕22例。两组患者促排卵时的平均年龄、不孕年限、基础FSH值、解冻胚胎移植日子宫内膜厚度比较，差异均无统计学意义，具有可比性，见表1。
表1 两组患者一般情况比较
2.玻璃化冻融对CLGC发育胚胎的影响：研究组玻璃化冷冻复苏58个周期，解冻157个胚胎，存活126个胚胎，复苏存活率80.3%(126/157)；胚胎卵裂球部分退化29个,胚胎卵裂球部分退化率18.5%(29/157)；胚胎卵裂球完整97个，完整胚胎率61.8%(97/157)。
3.玻璃化冻融对CLGC发育的胚胎移植后妊娠结局的影响：研究组移植58周期(解冻后4周期无胚胎移植)，临床妊娠16个周期，临床妊娠率29.6%(16/54)，移植126个胚胎，种植率18.3%(23/126)，流产率25.0%(4/16)。对照组移植48周期，临床妊娠17周期，临床妊娠率35.4%(17/48)，移植102个胚胎，种植率29.4%(30/102)，流产率11.8%(2/17)。研究组的种植率低于对照组，差异有统计学意义；研究组的临床妊娠率略低于对照组、流产率略高于对照组；两组的临床妊娠率、流产率比较差异无统计学意义。见表2。
研究组中有2例患者D3天胚胎解冻后移植困难，胚胎在囊胚液中继续培养两天(COOK三气培养箱)，D5天移植，2例患者均有一个胚胎解冻后卵裂球完整，但培养后停止发育，另一个胚胎解冻后卵裂球完整发育为4AA囊胚，移植后2例患者单胎妊娠。
表2 玻璃化冻融对CLGC发育的胚胎移植后妊娠结局的影响
注：与对照组相比，*P<0.05
讨论
玻璃化冷冻技术常规应用于人类胚胎的保存[5-6]，该法通过浓度高达6～9 mol/L的冷冻保护剂使玻璃化溶液直接变为玻璃态而实现。然而，在玻璃化冻融过程中高浓度的冷冻保护剂会通过毒性作用和渗透性休克对胚胎产生冷冻损伤。有文献报道，无论是物理的或化学的损伤均可导致胚胎透明带硬化，裂解和细胞死亡、细胞骨架结构破坏、线粒体代谢失活、染色体异常等，并最终降低胚胎的发育潜能[1]。因此，玻璃化冷冻有可能降低胚胎的发育潜能。CLGC是一种常见的卵母细胞胞浆形态异常。史中娜等[7]的研究发现CLGC可能影响其受精、胚胎发育及囊胚的形成。那么，玻璃化冻融是否会使CLGC来源的胚胎的发育潜能进一步的降低？目前国内对于玻璃化冷冻对CLGC胚胎的影响进行的研究较少。
文献报道胚胎卵裂球的完整率是衡量玻璃化冷冻效果的关键指标[8]。玻璃化冻融后胚胎的损伤表现主要为胚胎完整率明显下降，胚胎卵裂球部分或完全损伤，胚胎碎片增加。此现象与DMSO的细胞毒性有关[9]。本研究中CLGC形成的胚胎玻璃化冻融后胚胎完整率为61.8%，明显低于正常胚胎玻璃化冻融后的胚胎完整率(一般为80%以上)。这一现象提示，CLGC形成的胚胎比正常胚胎更容易受到冷冻保护剂的损伤。Balaban等[10]报道来自CLGC的胚胎冻融后的生存和体外发育能力均下降。本研究中，研究组种植率低于对照组，差异有统计学意义；研究组的临床妊娠率低于对照组，流产率高于对照组，但差异均无统计学意义。这提示CLGC形成的胚胎玻璃化冻融后的生存和发育潜能明显下降，与Balaban等[10]的结论一致。
当前关于CLGC形成的原因和机制并无一致意见。杨菁等[3]研究考虑患者的年龄、基因缺陷以及临床降调节方案等均可能是导致卵母细胞胞浆形态异常的原因。这提示辅助生殖治疗的相关环节(基础FSH值、卵巢功能低下、促性腺激素使用时间较长及大剂量等)可能与CLGC的形成有关。而CLGC胚胎经玻璃化冻融后的发育潜能明显下降。为了提高 CLGC胚胎移植周期的临床妊娠率，应通过合理的临床降调节方案尽量减少CLGC卵的产生。
本研究发现CLGC胚胎玻璃化解冻后行囊胚培养时有胚胎卵裂球全部完整但胚胎停止发育，这一现象表明CLGC胚胎损伤的形态学表现不仅可能表现为部分或全部卵裂球损伤，还可能为全部卵裂球完整但胚胎停止发育。一项研究[11]发现了此种人类胚胎X、Y及1号染色体数量异常，导致了胚胎有丝分裂的障碍。所以可以在患者知情同意的基础上对CLGC胚胎进行囊胚培养提高CLGC移植周期的妊娠率。
综上所述，胚胎质量是影响冻融胚胎移植妊娠结局的重要因素。由于卫生部176号文件规定患者移植胚胎数必须少于3个，因此对于CLGC胚胎有必要进行囊胚培养，通过筛选优质胚胎增加CLGC患者的移植周期临床妊娠率。最后对CLGC胚胎的移植应尽可能的采取新鲜胚胎移植策略或摸索损伤更小更合适的冻融方法。由于患者全部卵母细胞均为CLGC的病例，收集比较困难，进一步研究尚需增加CLGC患者的样本量。
参考文献
1 余兰,贾婵维,王树玉.慢速冷冻和玻璃化冷冻损伤对冻融胚胎的研究进展.中国优生与遗传杂志,2014,22:4-8.
2 曾惠明,王珊珊,张宁媛,等.冻融胚胎卵裂球损伤对于移植完整胚胎临床结局的影响.国际检验医学杂志,2013,34:3339-3340.
3 何驰华，杨菁.人卵母细胞胞浆中央颗粒化对胚胎发育潜能的影响和成因探讨.生殖医学杂志,2014,11:902-906.
4 Scott L.Pronuclear scoring as a predictor of embryo development.Reprod Biomed Online,2003,6:201-214.
5 Balaban B,Urman B,Ata B,et al.A randomized controlled study of human D3 embryo cryopreservation by slow freezing or vitrification:vitrification is associated with higher survival,metabolism and blastocyst formation.Hum Reprod,2008,23:1976-1982.
6 赵庆红,杨菁,尹太郎.玻璃化冷冻法和程序化冷冻法对人卵裂期胚胎冷冻复苏效果的比较.生殖与避孕,2010,30:592-595.
7 史中娜,任新玲,吴黎,等.卵母细胞胞质中央颗粒化对受精、胚胎发育及临床妊娠结局的影响.中国妇幼保健,2011,26:4553-4555.
8 郑爱燕,丁洁，顾 斌，等.玻璃化冷冻与程序化冷冻对胚胎发育潜能及临床结局的影响.生殖与避孕,2013,33:16-20.
9 Prentice-biensch JR,Sing J,Mapletoft RJ,et al.Vitrification of immature bovine cumulus-oocyte complexes：effects of cryoprotectants，the vitrification procedure and warming time on cleavage and embryo development.Reprod Biol Endocrinol,2012,10:73-79.
10 Balaban B，Urman B.Effect of oocyte morphology on embryo Development and implantation.Reprod Biomed Online,2006，12:608-615.
11 Chiang CH,Lin MW,Chung MY,et al.The associaton between the IL-4,ADRh2 and ADAM 33 Gene poly-morphisms and asthma in the Taiwanese population.J Chin Med Assoc,2012,75:635-643.