miRNAs是一类没有开放阅读框及蛋白质编码功能并高度保守的内源性小分子RNA，长度约为19～24个核苷酸，可以通过与靶基因mRNA 3'UTR完全互补或者不完全互补的结合，引起靶基因mRNA降解或者翻译抑制[1-2]。Let-7最早在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中发现，长度为21个核苷酸，参与调控线虫的时序性发育，决定线虫从幼虫到成虫的形态转变[3]。Let-7作为miRNAs中的一员，不仅参与动物器官发育调控、与肿瘤发生相关，而且近年来的研究发现let-7与妊娠相关。本文课题组前期利用高通量miRNAs测序开展了miRNAs在早孕蜕膜和流产蜕膜中的组学研究[4]，对蜕膜中miRNAs的表达进行检测。
一、let-7生物学生成
细胞核内编码let-7的基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录生成初始转录产物pri-let-7，pri-let-7在RNA酶III Drosha和结合蛋白DGCR8(DiGeorge syndrome Critical Region-8)形成的酶-蛋白复合体(Drosha-DGCR8)的作用下形成大约70个碱基左右的带有发夹结构的前体pre-let-7，pre-let-7在GTP 依赖的核质/细胞质转运蛋白 Exportin-5 的作用下从细胞核转运到细胞质中，在细胞质中ATP 依赖的RNA酶III Dicer进一步将pre-let-7 剪切成长约21 nt 的双链 let-7，双链let-7解旋加工形成成熟的单链let-7。成熟的let-7与蛋白Argonaute(AGO)，RNA酶III Dicer 和免疫缺陷病毒Ⅰ型反式激活应答元件RNA结合蛋白(HIV-1 Tar RNA binding protein,TRBP)共同形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)[5-6]参与基因表达的调控。
二、let-7的作用机制
目前已知的let-7调控靶基因的方式有两种。let-7与靶基因mRNA 3'UTR(3'-untranslated region)完全互补结合时，可直接切割降解靶基因mRNA；let-7与靶基因mRNA 3'UTR 不完全互补结合时，可阻止转录后的翻译，此过程并不影响靶基因的稳定性，比如在线虫中let-7与靶基因3'UTR不完全配对结合后，阻遏调节基因的翻译[2]。此外，Kedde 等[7]研究发现RNA结合蛋白Dnd1(dead end-1)通过miRNAs靶向mRNAs上尿嘧啶富集区的介导可以结合到mRNAs上，抑制miRNAs与其靶位点相互作用，进而减弱了人的细胞系Tera1(一种来源于人的生殖细胞肿瘤的细胞系)中miR-372家族对LATS2表达的抑制和斑马鱼原代生殖细胞中miR-430对Nanos1和TDRD7的表达的抑制。
三、let-7在肿瘤中的研究
研究结果显示多数miRNAs充当肿瘤抑制子而另外一些miRNAs充当致癌基因[8-9]。Let-7是目前研究最多的miRNAs之一，已有研究报道let-7基因在人类的乳腺癌，肺癌和结肠癌组织中显著下调[10-13]。Ping等[14]分析了25例子宫内膜癌组织和邻近正常的子宫内膜组织中miRNA表达谱，发现203个miRNAs上调，147个miRNAs下调，其中qRT-PCR分析验证了let-7a、let-7g、let-7i、let-7d、let-7b、let-7c和let-7e在子宫内膜癌组织中都显著下调。他们预测let-7a的靶基因并对功能注释，找到了Aurora-B，Myc，HMGA2和Ras 4种与肿瘤形成相关并上调表达的基因。已有文献证实[15-19]其中Myc，HMGA2(high-mobility group AT-look 2)和Ras是let-7的靶基因。Ping 等[14]进一步通过荧光素酶实验证实let-7a在293T细胞中可以抑制Aurora-B 3'UTR的活性，此外let-7a还可抑制HMGA2和Ras 3'UTR的活性。利用qPCR验证let-7a和Aurora-B的表达，表明let-7a在子宫内膜癌组织和癌细胞系中的表达量很低而Aurora-B表达水平较高。在Hela细胞中过表达let-7a，Aurora-B的蛋白水平表达降低，提示Aurora-B可能是let-7a的靶基因。此外，在Hela细胞中过表达let-7a显著降低细胞活性和克隆形成率。利用siRNA敲除Hela细胞中Aurora-B的表达，细胞的生长受到抑制；过表达Aurora-B可以促进细胞生长。当let-7a类似物与Aurora-B共转染时，Aurora-B蛋白水平降低，表明let-7a有可能通过下调Aurora-B抑制子宫内膜癌细胞的生长。刘祖翠等[20]的研究表明let-7g在子宫内膜癌RL-95-2细胞中结合到RB1(retinoblastoma-associated protein 1)的3'UTR，对RB1 表达进行负调控,从而促进细胞生长。
四、let-7与哺乳动物的妊娠
Let-7家族不仅仅与子宫内膜癌有关。此外，let-7家族与早期妊娠维持有关。Miles等[21]对牛的卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes，COCs)中miRNAs表达丰度的研究表明，let-7b、let-7i、let-7f和let-7e在牛COCs中表达量很高。利用qPCR对不同大小卵泡的卵母细胞、COCs、颗粒细胞中let-7b、let-7i和miR-106a表达分析发现let-7b、let-7i 的表达没有差异；miR-106a在卵母细胞中的表达显著高于在COCs和颗粒细胞中的表达。三种miRNAs在不同大小的卵泡中的表达没有显著差异。预测靶基因结合位点并用qPCR检测发现MYC mRNA和WEE1A mRNA在卵母细胞中的表达显著低于在COCs和颗粒细胞中的表达。MYC mRNA在大卵泡COCs中的表达显著低于在小卵泡COCs中的表达。WEE1A mRNA在卵泡COCs中表达与卵泡大小无关。同时分析miRNAs加工过程相关基因RNASEN，DGCR8，XPO5，DICER1，TARBP2和EIF2C2在卵母细胞的表达显著高于在COCs和颗粒细胞中的表达，提示let-7b、let-7i和miR-106a可能通过调控MYC和WEE1A的转录参与卵母细胞的发育。
子宫内膜能够接受胚胎仅在一个限定的时间内即着床窗口期，在这一时期子宫内膜与囊胚滋养层之间的相互作用影响胚胎的成功附着与植入。在这一过程中，不仅有一系列的生长因子和细胞因子参与，一些miRNAs也参与其中。Geng等[22]对怀孕第5天的小鼠子宫内膜中着床位点(IMs)和非着床位点(inter-IMs)的miRNAs表达谱的分析表明，在着床位点有30种miRNAs表达上调，其中包括let-7b、let-7g和let-7i；有42种miRNAs表达下调。Hu等[23]通过miRNAs Microarray分析小鼠子宫中和inter-IMs中miRNAs的表达，发现let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g和let-7i在IMs的表达上调。Northern blotting和原位杂交的结果证实let-7a、let-7b、let-7c和let-7d在IMs的表达上调。此外，Fu等[24]从未经促排卵的怀孕1到4 d的小鼠子宫中分别分离得到上皮细胞和间质细胞，分析let-7b在这些不同时间段细胞中的表达，结果显示在上皮细胞中let-7b的表达从怀孕第1天到怀孕第4天逐渐增加并在怀孕第4天达到高峰；而在间质细胞中，let-7b的表达在怀孕第1天最高，在怀孕第2天和第3天显著降低，然后在第4天时显著增加。通过原位杂交表明在怀孕6～8 d时let-7b在非着床位点的累积低于在着床位点的累积，并在怀孕第7天遍布蜕膜，在第8天的胚胎中let-7b的信号几乎完全消失。同时发现雌二醇和孕酮都可以显著增加let-7b在上皮细胞的表达。用脂质体转染let-7b前体到怀孕4 d的小鼠间质细胞，发现细胞数量显著减少，细胞增殖减慢。当共转染let-7b和let-7b抑制剂时，细胞增殖活性显著恢复。此外过表达let-7b可以显著下调Bsg和MMP-9的表达。Lozoya等[25]通过qRT-PCR分析了正常妊娠早期(孕5～9周)和宫外孕早期胚性组织中let-7a的表达，发现在正常妊娠早期let-7a在5～6周的胚性组织中的表达最高，在第7周时显著下降直到第9周仍然表达很低；而宫外孕妊娠早期let-7a在5-6周的胚性组织中的表达显著低于对照组。这就提示在妊娠早期let-7a的异常表达可能与异位着床有关。
Let-7家族在妊娠相关组织中的表达也具有组织特异性。Chan等[26]的研究表明let-7b和let-7c在蜕膜组织中的表达显著低于胎盘和羊膜组织中的表达；而let-7d和let-7f在羊膜组织中的表达低于蜕膜和胎盘组织中的表达。let-7家族在早期发育中差异表达[27-28]。Let-7家族在成熟的卵母细胞和受精卵中高表达，在2-细胞期表达减少。liu等[29]通过miRNA表达谱分析了休眠囊胚和激活囊胚中miRNAs的表达，结果发现let-7a、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g在休眠囊胚中的表达高于在激活的囊胚中的表达，qPCR证实let-7a和let-7e在休眠囊胚中的表达显著高于活化囊胚中的表达。利用电穿孔法将前体let-7a转入8-细胞期的胚胎，发现胚胎的粘附和植入能力显著降低。双荧光素酶实验和Western Blot 结果表明integrin-β3是let-7a在小鼠囊胚中的一个靶基因。Let-7a影响囊胚植入一个可能的原因就是通过调节integrin-β3的表达实现。Cheong等[30]的研究表明初级let-7a和成熟的let-7a在第4天的囊胚中的表达量都很低；而囊胚诱导休眠后，初级let-7a和成熟的let-7a的表达显著提高；利用雌二醇激活囊胚后，在激活后1 h之内let-7a的表达被抑制，随后初级let-7a的表达不变而成熟的let-7a的表达降低。RNase III dicer在休眠囊胚中的表达显著低于在第4 天的囊胚中的表达，当雌二醇重新激活囊胚后，它的表达又恢复到原来的水平。通过双荧光素酶实验证实let-7a与dicer相互作用。检测植入前胚胎中初级let-7a和成熟let-7a及dicer的表达，发现初级let-7a在胚胎2细胞期高表达，在囊胚期表达降低；成熟的let-7a在卵母细胞中高表达，在囊胚中表达降低；而dicer的表达在整个植入前阶段基本保持不变。在5～8细胞的胚胎中转染let-7a前体不会影响初级let-7a的表达但会显著增加成熟let-7a的表达，let-7a抑制剂会显著抑制初级的和成熟的let-7a。过表达let-7a会显著抑制dicer转录本和蛋白的表达，抑制let-7a不会影响dicer转录本的表达但会使dicer蛋白的表达增加。利用电穿孔法将dicer siRNA 转入5～8细胞的胚胎中，dicer的表达降低，同时成熟let-7a的表达显著下调，囊胚的着床率减少。这些结果表明let-7a与dicer的相互作用对延迟植入的小鼠胚胎的激活和着床有重要作用。
综上所述，let-7家族与哺乳动物妊娠及妊娠维持有着举足轻重的作用，值得不断深入研究。
五、展望
随着对let-7家族研究的不断深入，let-7家族在妊娠过程中的作用被不断的发掘，但是一些作用机制目前仍然不清楚。随着研究的进一步深入，let-7家族在哺乳动物妊娠过程中的作用会进一步得到阐释，为miRNAs参与调节妊娠机制提供思路和线索。
参考文献
1 Meltzer PS.Cancer genomics:small RNAs with big impacts.Nature,2005,435:745-746.
2 Martinez J,Tuschl T.RISC is a 5'phosphomonoester-producing RNA endonuclease.Genes Dev,2004,18:975-980.
3 Reinhart BJ,Slack FJ,Basson M,et al.The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans.Nature,2000,403:901-906.
4 Wang Y,Lv Y,Wang L,et al.MicroRNAome in decidua:a new approach to assess the maintenance of pregnancy.Fertil Steril,2015,103:980-989.e6.
5 Gregory RI,Chendrimada TP,Cooch N,et al.Human RISC couples microRNA biogenesis and posttranscriptional gene silencing.Cell,2005,123:631-640.
6 Lagos-Quintana M,Rauhut R,Lendeckel W,et al.Identification of novel genes coding for small expressed RNAs.Science,2001,294:853-858.
7 Kedde M,Strasser MJ,Boldajipour B,et al.RNA-binding protein Dnd1 inhibits microRNA access to target mRNA.Cell,2007,131:1273-1286.
8 Garzon R,Calin GA ,Croce CM.MicroRNAs in cancer .Annu Rev Med,2009,60:167-179.
9 Spizzo R,Nicoloso MS,Croce CM,et al.SnapShot:microRNAs in cancer.Cell,2009,137:586-586.
10 Yu F,Yao H,Zhu P,et al.Let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells.Cell ,2007,131:1109-1123.
11 Takamizawa J,Konishi H,Yanagisawa K,et al.Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival.Cancer Res,2004,64:3753-3756.
12 Akao Y,Nakagawa Y,Naoe T.Let-7 microRNA functions as a potential growth suppressor in human colon cancer cells.Biol Pharm Bull,2006,29:903-906.
13 Bussing I,Slack F J,Grosshans H.Let-7 microRNAs in development,stem cells and cancer.Trends Mol Med,2008,14:400-409.
14 Liu P,Qi M,Ma C,et al.Let7a inhibits the growth of endometrial carcinoma cells by targeting.Aurora-B.FEBS Letters,2013,587:2523-2529.
15 Johnson SM,Grosshans H,Shingara J,et al.RAS is regulated by the let-7 microRNA family.Cell,2005,120:635-647.
16 Koscianska E,Baev V,Skreka K,et al.Prediction and preliminary validation of oncogene regulation by miRNAs.BMC Mol Biol.2007,8:79.
17 Kumar MS,Lu J,Mercer KL,et al.Impaired microRNA processing enhances cellular transformation and tumorigenesis.Nat Genet,2007,39:673-677.
18 Lee,YS ,Dutta A.The tumor suppressor microRNA let-7 represses the HMGA2 oncogene.Genes Dev,2007,21:1025-1030.
19 Park SM,Shell S,Radjabi AR,et al.Let-7 prevents early cancer progression by suppressing expression of the embryonic gene HMGA2.Cell Cycle,2007,6:2585-2590.
20 刘祖翠,陈国庆,陈渝,等.let-7g 对子宫内膜癌 RL-95-2 细胞中RB1 表达的调控.生殖与避孕,2013,33:306-310.
21 Miles JR,McDaneld TG,Wiedmann RT,et al.MicroRNA expression profile in bovine cumulus-oocyte complexes:possible role of let-7 and miR-106a in the development of bovine oocytes.Anim Reprod Sci,2012,130:16-26.
22 Geng Y,He J,Ding Y,et al.The differential expression of microRNAs between implantation sites and interimplantation sites in early pregnancy in mice and their potential functions.Reprod Sci,2014,21:1296-1306.
23 Hu SJ,Ren G,Liu JL,et al.MicroRNA expression and regulation in mouse uterus during embryo implantation.J Biol Chem,2008,283:23473-23484.
24 Fu TY,Lin CT,Tang PC.Steroid hormone-regulated let-7b mediates cell proliferation and basigin expression in the mouse endometrium.J Reprod Dev,2011,57:627-635.
25 Lozoya T,Dom
nguez F,Romero-Ruiz A,et al.The Lin28/Let-7 system in early human embryonic tissue and ectopic pregnancy.PLoS One,2014,9:e87698.
26 Chan HW,Lappas M,Yee SW,et al.The expression of the let-7 miRNAs and Lin28 signalling pathway in human term gestational tissues.Placenta,2013,34:443-448.
27 Tang F,Kaneda M,O’Carroll D,et al.Maternal microRNAs are essential for mouse zygotic development .Genes Dev,2007,21:644-648.
28 Viswanathan SR,Mermel CH,Lu J,et al.MicroRNA expression during trophectoderm specification.PLoS One,2009,4:e6143.
29 Liu WM,Pang RT,Cheong AW,et al.Involvement of microRNA let-7a in the regulation of embryo implantation in mice.PLoS One,2012,7:e37039.
30 Cheong AW,Pang RT,Liu WM,et al.MicroRNA Let-7a and dicer are important in the activation and implantation of delayed implanting mouse embryos.Hum Reprod,2014,29:750-762.