自从人类基因图谱绘制完成后，人类即步入了后基因组时代，基因组研究的重心由基因的DNA序列测定转向基因的生物学功能。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年发展起来的一种新兴的由双链RNA(dsRNA)发起的一种同源依赖的基因沉默技术，这个过程依赖于dsRNA短片段的能力，以识别和引导互补的mRNA转录成RNA诱导的沉默复合体(RISC)。一旦易位到RISC复合物中，mRNA转录物被裂解，并最终在细胞内降解，使它们无效地翻译到蛋白质里，同时，干扰RNA序列被保存下来并不断循环再沉默事件[1]。
一、RNA干扰技术的发展历程
RNA干扰作为一种新颖的自然现象首先在转基因植物中被报道，科学家在矮牵牛花中导入查尔酮基因却发现由于内源性的同源基因被沉默，本应出现的暗紫色花朵变成了白色或是白紫色混合的花朵，该现象被称为“共抑制”[2]。Fire等[3]通过线虫研究发现双链RNA与单链的相比，其干扰作用更显著，这种双链RNA产生的基因沉默现象即称为RNAi。随后，一些小RNA也逐渐运用到RNA干扰技术中，最主要的两类为小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)[4]，还有引导PIWI蛋白质指示染色质修饰和转座子沉默的piRNA、短发卡RNA(shRNA)[5]等。
二、RNA干扰技术的方法学进展
如何有效的把特定标靶的RNA递送到位，使其产生基因沉默效应，是RNA干扰技术研究的重点。要使基因沉默得以高效进行，依赖于将有效的干扰RNA递送至靶细胞，并防止该RNA片段在内吞后的溶酶体内被降解。因此，各项研究着重于靶向RNA的合成，递送方式、材料等的设计和优化。
1.siRNA的合成：靶向RNA序列的选择是至关重要的。靶序列可以通过体外的化学合成、体内外转录法以及酶消化法合成。迄今为止，大多数siRNAs可通过化学合成产生。Huang等[6]提出一种前体RNA(pro-RNA)技术，该技术可以有效抑制多形细胞或病毒基因，并且提供了可靠的和可再生的siRNAs资源。这种前体RNA技术还可用于药物的递送，通过制备基于RNA的保护生物不稳定性的前体药物，有利于细胞吸收以及除去细胞内的酶，增加细胞摄取量，这种前体RNA增加的细胞输送量约是常规的siRNA的2倍以上[7]。
2.siRNA的递送：(1)改良的病毒载体。腺病毒和逆转录病毒被发现可以成为基因治疗载体，介导干扰 RNA的递送。慢病毒属于逆转录病毒，因其转染效率高，且对分裂期和非分裂期细胞都有效，常常运用于RNA干扰技术，为抗病毒感染、癌症治疗、心脑血管疾病等方面的研究开拓了新局面[8-9]。(2)脂质体。脂质体常常作为siRNA递送的支架，体外即可成功转染，利用这种脂质体递送系统，可有效沉默标靶基因[10]，还能用于全身给药，实现高效的细胞内输送，成为治疗实体瘤的一种有效工具[11]。(3)聚合物。使用聚乙烯亚胺(PEI)作为基因载体已被广泛地研究，因转染的siRNA易被RNA酶降解，许多研究通过对PEI的加工修饰合成了功能更为强大的载体[12]。例如与小分子RNA形成纳米复合物，在细胞运输和细胞内释放过程中保护RNA[13]，或者结合天然高分子材料降低PEI的细胞毒性，提高转染效率，作为肿瘤靶向siRNA递送的非病毒载体，有效针对靶组织[14]。
三、基因沉默在子宫内膜容受性相关基因研究中的运用
胚胎着床是发育的胚胎黏附以及着床到容受的子宫内膜上的过程。容受的子宫内膜的形成是一个受限制的时期，称为“子宫内膜容受窗期”。子宫内膜容受窗期是由许多复杂分子，如激素、细胞因子、黏附分子和生长因子以及他们之间的相互作用所调控。广大研究者们在寻找确切有效且可用于临床实践的生物标记物的道路上不懈努力。研究较多的生物标记物包括形态学标记的胞饮突，细胞因子如白血病抑制因子(LIF)，白细胞介素6(IL-6)、IL-11，生长因子如胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF),黏附因子如整合素、选择素等。在子宫内膜容受性研究中使用RNA干扰技术可进一步了解相关基因的功能。
1．生长因子：Dadi等[15]使用RNA干扰技术证实了经RNA干扰后胚胎的EGF、TGFα(转化生长因子-α)以及EGF-R的表达减少，这将影响胚胎的存活和延迟植入前的胚胎发育。当干扰雌性小鼠的HB-EGF表达后，胚胎着床率则显著下降[16]；胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)大量表达于月经周期分泌期的子宫腺上皮细胞,特定的siRNA沉默其表达后，导致异常的MAPK信号通路形成，干扰腺细胞的形态学变化，影响胚胎着床[17]。研究表明，生长因子家族中许多成员都对胚胎的发育、植入和子宫内环境形成发展起重要作用。
2．黏附因子：黏附因子家族常通过配体-受体相对应的形式发挥作用，参与细胞间与基质间的黏附，细胞的信号转导等过程。通过特异性RNA干扰黏附因子CD82、CD98后人类胚胎JAR细胞黏附至RL95-2细胞单层的黏附率显著下降，小鼠胚泡黏附数显著下降，结果提示这些黏附因子可能是子宫内膜植入窗期容受性改变的关键决定因素[18-19]。
3．转录因子：同源框基因HOXA10在整个月经周期的子宫内膜腺体和间质细胞均有表达，在植入时表达最高，有研究表明可通过防止过早分化和凋亡而控制蜕膜化过程[20]。若干扰HOXA10的表达，将导致植入率下降[21]，且蜕膜化缺陷会导致复发性流产和不孕不育[22]。这些结果均提示HOXA10在子宫内膜间质细胞生理功能的调控中起重要作用。
4．修饰蛋白：调节子宫内膜容受性的过程中还有许多修饰蛋白参与其中，研究较多的是半乳糖凝集素-3(GAL-3)，GAL-3是子宫内膜中可检测到的β-半乳糖苷结合蛋白，由于其在胚胎着床期间在子宫内膜和滋养层细胞的表达增加，故认为与子宫内膜容受性相关[23]。若干扰子宫内膜GAL-3的表达，会延缓子宫内膜细胞的增殖，从而延缓适于胚胎着床的子宫内膜环境的形成，减少了胚胎植入的数目[24]，但仍有少量胚胎附着，说明在胚胎着床期间GAL-3并非唯一调控因子，还存在其他因子共同参与，当GAL-3的表达下降，整合素integrin β3的表达也会受影响，二者共同调节子宫内膜细胞的增殖和黏附[25]。Glycodelin是一种孕酮调节糖蛋白，高度表达于分泌期的人子宫内膜。排卵后4-5d Glycodelin在子宫内膜腺体中的浓度逐渐增大，在第10天达到顶峰，与植入窗的时间重合。异常浓度的Glycodelin与不明原因不孕和早期流产相关。So等[26]通过RNAi敲除Glycodelin表达后发现细胞迁移率上升，而增强Glycodelin表达后球体粘附率上升。还有Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶(SIRT1)通过调节E-cadherin蛋白的表达共同参与胚胎附着的最初阶段[27]；下调S100A11蛋白的表达，弱化了小鼠胚胎的着床和JAR球体附着于子宫内膜细胞，改变了子宫内膜容受性和免疫耐受相关因素的表达水平[28]；而干扰容受期细胞外基质蛋白Olfm-1的表达将有利于胚胎黏附使其成功植入[29]。越来越多的因子通过RNA干扰技术发现与子宫内膜容受性相关，这将为改善子宫内膜容受性，增加着床率，减少流产率等治疗提供有力的分子基础。
基因芯片技术检测着床窗期的子宫内膜发现有300余种基因表达下调，其中对粘蛋白(MUC-1)、基质金属蛋白酶(MMPs)等因子研究较多，这些因子在子宫内膜上皮形成过程中起重要作用，被认为是子宫内膜的特异调节因子，在此期间如果表达上升将妨碍子宫内膜的构建，导致胚胎种植失败[30]。使用RNA干扰技术可使这部分因子沉默，体外合成可与靶基因的互补mRNA结合的特异RNA,通过子宫局部注射或者静脉注射到达子宫，使mRNA降解,抑制靶基因的表达。如此，把子宫内膜的容受性调整至最佳状态，将有望大幅提高胚胎种植率。
四、结语
RNA干扰技术与传统的基因沉默方法如基因敲除、反义寡核苷酸技术相比较而言，RNA干扰技术基因沉默的灭活效果更为可靠，低浓度下也具有高效特异性，且操作上相对简单,具有极大的优势。在对不孕患者行体外受精-胚胎移植治疗时，成功的胚胎着床不仅依赖于选择优质胚胎进行移植，更需与容受期的子宫内膜完美结合，然而临床妊娠率仅为30%～40%，研究表明约2/3的胚胎植入失败与不充分的子宫内膜容受性相关。调节子宫内膜容受性是由各种基因、分子、信号通路共同参与的，在基础研究中可以运用RNA干扰技术提高对基因功能的认识，帮助人们不断深入子宫内膜容受性基因表达调控的本质，明确各种基因的功能定位，识别作用于胚胎发育、子宫内膜生长、黏附着床的各种因子，而人们正在为探寻相关生物标志物而不断努力。RNA干扰技术也开始引入临床，主要用于一些肿瘤、病毒病以及眼科疾病的治疗。在不孕患者的诊治中，可以通过基因芯片技术筛检出个人的基因表达，在已有研究的基础上，对表达下降的基因进行扩增，对表达上升的基因用RNA干扰技术使其沉默或表达下降，这将解决一大批不孕患者尤其是那些不明原因性不孕或反复流产患者的难题。
RNA干扰技术运用于临床仍处于试验阶段，基因库中各种因子的功能定位以及相互之间的调控关系需要不断深入明确，开发更加简单便捷、精确有效、成本低廉的靶向RNA片段合成、递送方法，评估其高效性、高度安全性以及毒副作用，形成一个成熟的RNA干扰技术体系运用到临床治疗中。随着研究的不断深入，RNA干扰技术必将为疾病在基因治疗领域开辟更加光明的道路。
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