多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育龄期女性常见的一种伴有糖代谢异常的生殖功能障碍性综合征，临床主要表现为高雄激素血症、排卵功能障碍和卵巢的多囊状态，对女性身心健康造成严重危害[1]。目前，卵泡液微环境中细胞因子的研究已成为当前生殖生理研究热点[2]。卵泡的发育受阻及优势卵泡选择闭锁与颗粒细胞的凋亡调控相关[2-3]。骨形态发生蛋白-15(bone morphogenetic protein-15，BMP15)作为卵母细胞特异性分泌因子，通过其相应受体BMPRⅡ参与了卵母细胞及颗粒细胞代谢的多项调节[4]。本研究通过比较PCOS与正常排卵患者颗粒细胞凋亡情况及BMP15和BMPRⅡ的表达差异，初步探讨PCOS患者体内卵源性因子BMP15及其受体BMPRⅡ的异常表达对颗粒细胞增殖的影响，为改善临床PCOS患者的卵泡发育及妊娠率提供理论依据。
对象与方法
一、对象
选择2014年6月—2015年6月在本中心行体外受精-胚胎移植技术(IVF-ET)或卵胞质内单精子显微注射(ICSI)助孕治疗的患者216例，年龄23～35，平均(29.0±3.7)岁。符合2003年荷兰鹿特丹会议上制定的PCOS诊断标准的患者138例(PCOS组)，无排卵功能障碍的的因输卵管因素或男性不育接受IVF/ICSI治疗的患者78例(对照组)。排除标准：患者近3个月受过促排卵治疗或服用过促排卵治疗；曾接受过卵巢相关手术及放化疗治疗；患者合并有子宫内膜异位症、库欣综合症、卵巢功能早衰、肾上腺肿瘤及卵巢男性化肿瘤等。本研究已由山西省妇幼保健(儿童)医院伦理委员会批准，患者均签署了知情同意书。
二、方法
1.卵巢刺激方案：本研究中PCOS患者于治疗周期前需口服避孕药达英-35或妈富隆进行预处理，以便降低高雄激素血症及调整患者月经周期。患者均采用标准激动剂COH(controlled ovarian hyper-stimulation，控制性超排卵)方案，于上1个月经周期的黄体期开始注射GnRH-a(醋酸曲普瑞林，金磊，长春金赛药业有限责任公司)0.05 mg/d进行降调节，且于本次促排卵周期月经来潮第3～5天给予醋酸曲普瑞林0.05 mg/d的同时合并促性腺激素(Gn，尿促卵泡素，urofollitropin,丽申宝，珠海丽珠制药公司)促排卵，启动剂量为75～300 U/d，当有3枚以上卵泡直径≥18 mm时停用丽申宝及金磊，并于当晚10:00左右给予人绒毛膜促性腺激素(hCG，珠海丽珠制药公司)5 000～10 000 U肌肉注射，注射hCG后36～38 h行超声引导下经阴道穿刺取卵术。于取卵后4～6 h，根据具体情况行IVF-ET或ICSI。同时于取卵后第3天，根据胚胎形态学相关参数选择1～2个Ⅰ—Ⅱ级胚胎移植，或于取卵后第5天行囊胚移植，移植日起给予黄体支持60 mg/d。
2.临床妊娠判断标准：胚胎移植后的第12～14天，测尿hCG或血hCG，初步判断是否生化妊娠，若生化妊娠则继续用药1～2周，且于移植后4周行超声检查确定临床妊娠及孕囊数目，宫内发现原始胎心搏动诊断为活胎宫内妊娠。
3.卵泡液及颗粒细胞的收集：于患者取卵当天，收集PCOS及正常排卵妇女的未经血液污染的卵泡液，经4 000 r/min离心30 min，将上清液收集变为分析用卵泡液，且将其封存于15 ml离心管内，于-80 ℃冰箱冻存备用。用PBS将卵泡液离心后的沉淀清洗3次，用PBS(1 ml)将其混匀，随后用吸管将其吸取且加入具有等体积的淋巴细胞分离液中，于2 500 r/min条件下离心20 min，将第2层颗粒细胞(白色云雾状细胞团)收集于新的离心管内，且用PBS将其清洗3次后于-80 ℃冰箱冻存备用，用于相关指标检测。
4.临床参数及妊娠结局收集：记录年龄、体重、身高、基础性激素水平、Gn用量、获卵数、MⅡ卵数、受精率、卵裂率、可移植胚胎数、优质胚胎数、平均移植胚胎数、胚胎种植数，并患者临床妊娠情况进行随访。
5.Real-time PCR检测膜受体BMPRⅡ、Bcl-2及Caspase3 mRNA转录水平：用PBS将收集的卵丘颗粒细胞洗涤3次，采用RNA提取试剂盒(TIANGEN，天根生化科技有限公司)提取细胞总RNA进行逆转录，采用Real-time PCR对逆转录的cDNA进行PCR扩增。以β-actin为内参，进而优化反应条件，使目的基因与内参的扩增效率接近100%，Ct值代表基因的起始拷贝数，可根据Ct值比较基因的表达量。△△Ct =(Ct目的基因-Ct内参基因)-(Ct阴性对照-Ct内参基因)，以2-△△Ct计算各组mRNA的相对表达量。基因引物序列如下：BMPRⅡ上游5′-CGGCTGCTTCGCAGAATCA-3′，下游5′-TCTTGGGGATCTCCA ATGTGAG-3′；Bcl-2上游5′-GGTGGGGTCATGTGTGTGG-3′，下游5′-CGGTTCAGGTACTCA GTCATCC-3′；Caspase-3上游5′-CATGGAAGCGAATCAA TGGACT-3′，下游5′-CTGTA CCAGACCGAGATG TCA-3′；β-actin上游5TGTACGTTGCTATC CAGGCT3，下游5′-CTCCTT AATGTCACGCACG A-3′，所有引物均由上海Invitrogen生物工程有限公司合成。
6.Western blotting 检测卵泡液中BMP15的蛋白表达水平：取4 μl蛋白上样缓冲液与20 μl卵泡液混合，于100 ℃煮沸10 min。随后采用SDS-PAGE胶对卵泡液中的蛋白进行电泳分离，采用半干转膜，用5%的牛奶封闭液对PVDF膜进行封闭1 h，随后加入BMP15的多克隆一抗(Proteintech公司)于4 ℃摇床孵育过夜。辣根过氧化物酶标二抗(康为世纪)孵育2 h后，加入化学发光剂曝光。各组以β-actin为研究内参，比较各组卵泡液中蛋白的相对表达水平。
7.流式细胞仪检测颗粒细胞凋亡率：用PBS将颗粒细胞洗涤3次后，将颗粒细胞悬液的深度调整到1×106个/ml，随后取1 ml颗粒细胞悬液经1 000 r/min离心10 min，去PBS后垂直加入预冷的70%乙醇中固定1～2 h。经离心将固定液弃去，于3 ml PBS中重悬5 min，再经1000 r/min离心5 min，弃去PBS，加入碘化丙啶(propidium iodide，PI，100 μg/ml)于4 ℃避光30 min上机。于PI荧光的直方图上，凋亡细胞于G1/G0期会出现一个亚二倍体峰，其所占样本数的比例即为颗粒细胞凋亡率。
8.统计学处理：采用SPSS 17.0统计学软件，计量资料用
表示，采用t检验；计数资料用率(%)表示，率的比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、两组一般参数及妊娠结局的比较
两组MⅡ卵率、受精率、优质胚胎率、临床妊娠率比较，差异无统计学意义；PCOS组年龄、BMI指数、基础性激素E2、LH、获卵数及T水平高于对照组，可移植胚胎率、PRL、基础FSH水平及Gn用量低于对照组，差异均有统计学意义；见表1。
表1 两组一般参数及妊娠结局比较
注：两组比较，*P<0.05
二、两组颗粒细胞凋亡情况
两组卵丘颗粒细胞固定后于流式细胞仪上检测其凋亡率，PCOS组颗粒细胞凋亡细胞的DNA含量为(3.58±0.49)%高于对照组(1.41±0.03)%，差异有统计学意义(图1)。
图1 两组颗粒细胞凋亡情况
三、两组BMPRⅡ、Bcl-2及Caspase3 mRNA转录水平
PCOS组凋亡调控基因Caspase-3、Bcl-2 及BMP15的受体BMPRⅡ的mRNA转录水平分别为(4.47±0.61)、(1.19±0.09)和(2.83±0.17)，对照组分别为(1.33±0.15)、(5.24±0.73)和(1.18±0.08)。PCOS组卵丘颗粒细胞内Bcl-2 mRNA转录水平显著低于对照组，而Caspase-3及BMPRⅡ mRNA转录水平高与对照组，差异均有统计学意义(图2)。
图2 两组BMPRⅡ、Bcl-2及Caspase3mRNA转录水平
四、两组卵泡液中卵源性蛋白BPM15的表达情况
PCOS组卵源性蛋白BMP15的表达水平为(0.84±0.16)，低于对照组(1.37±0.61)，差异有统计学意义(图3)。
图3 两组卵泡液中卵源性蛋白BPM15的表达
讨 论
PCOS是育龄期女性月经周期紊乱及无排卵性不孕的常见病因，临床表现呈多态性的内分泌代谢性疾病，其病理生理特点主要表现为卵泡发育障碍，然而病因尚不明确[5]。有研究发现，IVF-ET技术虽可使部分患者获得妊娠，但依然存在卵母细胞质量降低，受精率下降及流产率增加等问题[6]。本研究发现，PCOS患者可移植胚胎率低于对照组，两组MⅡ卵率、受精率、优质胚胎率、临床妊娠率比较，差异无统计学意义。其原因可能是前期在预处理过程中已采用达英-35及妈富隆进行处理，使得降调周期月经第3天时T及LH已达到正常水平，降低了由T及LH等不利因素对卵细胞及胚胎的影响，表明适当的预处理在保证PCOS患者获得较好的妊娠结局方面具有一定的意义。
目前认为，PCOS的发病是由多基因遗传与环境因素共同作用的结果，其中卵泡内微环境是影响卵母细胞的质量及卵裂能力的关键因素之一，可通过自分泌及旁分泌形式产生的局部调节因子构建一个不断变化而又相对稳定的微环境，进而影响卵泡的生长发育，在PCOS的发生、发展过程中发挥重要作用[6]。同时有研究表明，卵源性因子BMP15是卵巢功能及卵泡生长发育的重要调节因子，在卵泡发育及卵母细胞质量上发挥着关键作用，能够调控卵母细胞的成熟及优势卵泡的形成[7]。且动物研究发现，BMP15在正常卵泡发育过程中可促进卵泡生长且在促进卵泡生长上与FSH具有协同作用，同时还可抑制由FSH诱导的颗粒细胞分化[8-10]。因此，对本中心行IVF/ICSI助孕治疗的女性患者取卵当天卵泡液中的卵源性因子BMP15及颗粒细胞上的相应受体BMPRⅡ进行了检测，发现PCOS患者的卵泡液中BMP15的表达水平较对照组显著降低，与同类报道[11]一致。BMP15不仅是卵泡生成过程中重要的调控因子，且可通过旁分泌及自分泌作用参与卵丘扩展，对于维持卵母细胞的最佳微环境及正常排卵、受精具有重要意义。
BMPRⅡ主要表达在卵泡膜及颗粒细胞表面，同时有研究发现BMPRⅡmRNA表达于除原始卵泡颗粒细胞外的所有阶段卵母细胞和颗粒细胞中，且BMPRⅡ在颗粒细胞中的表达水平较卵泡膜细胞中的表达水平高，因此，可推测颗粒细胞是其主要的表达位点[9-10]。本研究发现，PCOS患者颗粒细胞BMPRⅡ可能作为BMP15降低的一种代偿机制，mRNA转录水平较对照组显著增高，提示BMPRⅡ在PCOS的发生发展过程中发挥一定作用。既往研究发现，BMPRⅡ在BMPs信号传递过程中起着重要作用，同时也是BMP15作用途径中不可缺少的成分，BMP15与BMPRⅡ结合才可发挥作用，进而引发细胞内Smad1/5/8快速而短暂的磷酸化反应，接着通过其下游信号通路的触发抑制颗粒细胞上FSH受体的表达而下调FSH[6,10]。推测，当PCOS卵巢BMPRⅡmRNA的表达量增高时，可进一步使BMP15抑制FSH诱导的颗粒细胞分化的作用加强，从而导致FSH调节颗粒细胞的分化作用降低，芳香化酶活性减弱，使得卵泡膜细胞将雄激素转变成雌激素的能力下降，进而导致雄激素堆积。
有研究发现，卵母细胞的质量受到颗粒细胞凋亡的影响，同时卵母细胞的状态可反向影响颗粒细胞的增殖，当卵母细胞移除后，颗粒细胞的凋亡率增加，向培养液中加入BMP15后可显著降低颗粒细胞的凋亡率[7, 9, 12]。本研究通过对颗粒细胞凋亡率的检测发现，PCOS患者的凋亡率较对照组显著增高，且凋亡相关基因Bcl-2表达下调而Caspase-3表达显著增高。由此可以推断，在PCOS患者体内存在BMP15信号通路的异常，而此通路的异常可能与颗粒细胞增殖存在一定的相关性。
综上所述，卵源性因子BMP15可于人的成熟卵泡的卵泡液中检测到，且于PCOS患者卵泡液中表达量显著降低，同时颗粒细胞上其相应受体BMPRⅡ表达显著增高，BMP15信号通路的异常可能是引发PCOS患者卵母细胞成熟障碍及胚胎发育潜能降低的重要因素。同时验证了PCOS患者颗粒细胞凋亡率的增加及凋亡调控蛋白的异常改变，说明BMP15及其受体BMPRⅡ的异常改变与PCOS的发病有一定的关系，且参与了卵巢颗粒细胞的凋亡过程，但要得到确切结论仍需进一步研究。
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