目前体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET)技术越发成熟，胚胎移植的数目趋向减少。新鲜周期移植后产生的剩余胚胎或因内膜薄、预防卵巢过度刺激等因素而取消移植的全部鲜胎，进行囊胚培养，可以有效地减少冷冻胚胎的数目，在冻融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer, FET)前对胚胎的发育潜能进行筛选，从而提高妊娠率，为单囊胚移植提供了重要的技术支持。FET成功率的关键因素包括胚胎的质量、内膜的接受性及胚胎和内膜的同步性[1-2]，因此，内膜的准备尤为重要。目前常用的FET内膜准备方案有激素替代周期、微刺激周期和自然周期。本研究冻融周期中的单囊胚移植主要采用这3种方案，对南京军区福州总医院生殖中心的681个单囊胚移植周期的临床资料进行回顾性分析。
对象与方法
一、对象
采用南京军区福州总医院生殖中心临床生殖医学管理系统数据库，检索并回顾性分析2011年11月—2015年4月在本院行FET患者的相关资料，共681例移植内膜厚度不小于8 mm的单囊胚移植的FET周期。按内膜准备方法的不同分为3组，激素替代周期495例(激素替代组)，自然周期142例(自然周期组)，微刺激周期44例(微刺激组)。纳入标准：(1)患者年龄20～45岁，平均(30.7±4.1)岁；(2)患者的体质量指数(BMI)≤25 kg/m2；(3)移植前均采用阴道B超或宫腔镜的方法排除内膜病变。剔除标准：(1)有习惯性流产病史；(2)单角子宫、纵隔子宫等子宫畸形，以及合并子宫肌瘤、子宫腺肌病等影响宫腔形态的患者。
二、方法
1.冻融胚胎来源：所有冻融胚胎均来自于本中心接受IVF(in vitro fertilization)或卵胞浆内单精子注射授精(intracytoplasmic sperminjection,ICSI)治疗的不孕患者，采用长方案、超长方案、拮抗剂、微刺激和自然周期等促排卵方案。受精方式为IVF、ICSI、rescue-ICSI或half-ICSI。受精后第3天，将胚胎培养情况告知患者，并将囊胚培养的优势与风险详细告知患者，征得患者同意后，换液继续培养囊胚。体外培养第5～7天观察囊胚情况，采用Aflatoonian的囊胚评分系统，3BB及其以上的囊胚予以冷冻[3]。移植的胚胎均为第5～7天冷冻优质囊胚。冷冻方法均采用玻璃化冷冻，解冻后移植的囊胎均符合移植标准。先复苏后培养2～4 h，囊胚重新扩张到具有正常内细胞团和滋养外胚层形态视为存活。
2.子宫内膜准备：(1)激素替代周期。常用于既往内膜薄、月经周期不规律或卵巢功能差者。于月经周期第1～2天开始口服芬吗通红片(雌二醇2 mg),服药1～4天每次1片，每日1次；服药5～8天每次1片，每日2次；服药9～12天每次1片，每日3次。服药第12天阴道B超监测内膜情况，当子宫内膜≥8 mm，血E2≥150 pg/ml，P<1.0 ng/ml时,予黄体酮60 mg/d肌肉注射，同时改口服芬吗通黄片(雌二醇2 mg+地屈孕酮10 mg)转化内膜，黄体酮注射的第6天上午行单囊胚移植，术后雌孕激素维持原量支持黄体。当子宫内膜<8 mm，予以增加芬吗通红片半片(雌二醇1 mg)塞阴道，口服同9～12天继续用药3～6天，当子宫内膜≥8 mm，血E2≥150 pg/ml，P<1.0 ng/ml时，同前处理，转化内膜。黄体支持同前。(2)自然周期。常用于月经周期规律、排卵正常患者，在月经周期第8～12天开始行阴道B超监测卵泡发育，当优势卵泡直径≥14 mm，子宫内膜≥8 mm，血E2≥150 pg/ml，P<1.0 ng/ml时，若血LH≥20 U/L，于当日下午14：00～16：00肌注hCG 10 000 U，注射后的第6天上午行单囊胚移植；若血LH<20 U/L，于当日晚上21：00肌注hCG 10 000 U，第7天上午行单囊胚移植，移植后予黄体酮40 mg/d肌肉注射或地屈孕酮片20 mg口服，每日2次，作为黄体支持。(3)微刺激周期。常用于排卵障碍及激素替代周期内膜不理想的患者，根据患者既往月经周期情况，于月经周期第3～5天开始予以来曲唑2.5～5 mg/d,口服3～5 d，月经第10天B超监测卵泡发育，若有直径≥12 mm的优势卵泡时，不加用HMG，继续每日B超监测，当优势卵泡直径≥14 mm，子宫内膜≥8 mm，血E2≥150 pg/ml，P<1.0 ng/ml时，根据血LH情况予hCG肌注，胚胎移植时间同自然周期；若月经第10天无直径≥14 mm的优势卵泡，则予HMG 75 U隔日或每日肌注直至优势卵泡直径≥14 mm，子宫内膜≥8 mm，血E2≥150 pg/ml，P<1.0 ng/ml时，根据血LH情况予hCG肌注，胚胎移植时间同自然周期，术后黄体支持亦同自然周期。
3.妊娠判断：囊胚移植后第12天进行检测。若血β-hCG>5 U/L，尿妊娠试验阳性，但B超未见孕囊者，则定义为生化妊娠；若血β-hCG>5 U/L，尿妊娠试验阳性，行B超检查见孕囊者，则定义为临床妊娠。妊娠12周以内的妊娠失败定义为早期流产。妊娠后黄体支持均至孕12周左右。临床妊娠率=临床妊娠的周期数/移植周期数；早期流产率=发生流产的周期数/临床妊娠周期数。
4.统计学处理 ：采用SPSS 17.0统计学软件，计量资料用均数±标准差表示，3组之间比较采用方差分析，两两比较采用t检验；计数资料用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、患者的一般情况
3组体重指数、原发不孕率、年龄、不孕年限、内膜转化日P值比较，差异均无统计学意义；自然周期组准备的子宫内膜厚度明显厚于其他两组，自然周期组内膜转化日E2低于其他两组，差异有统计学意义；见表1。
二、各组患者临床结局比较
3组生化妊娠率、临床妊娠率、异位妊娠率比较，差异均无统计学意义，见表2；激素替代组、自然周期组和微刺激组流产率分别为11.2%(35/312)、11.9%(10/84)、11.1%(3/27)，3组差异无统计学意义。
表1 3组一般资料比较
注：3组比较，*P<0.05
表2 3组FET的临床结局
讨 论
一、单囊胚移植
人类辅助生殖技术选择移植的胚胎数目较多，是造成了多胎妊娠的主要原因。减少胚胎移植数目是降低多胎妊娠率最有效的方法。由于卵裂期单胚胎移植的低种植率，实行单囊胚移植具有较高的妊娠率，同时能有效降低因多胎导致的减胎风险及流产、早产、低体重儿出生等多种并发症的风险。有学者对冷冻囊胚移植和冻融胚胎进行比较,发现囊胚解冻移植，能获得更高的妊娠率和种植率,且两者有差异[4]。这可能因为囊胚是由有发育潜能的卵裂期胚胎经过基因组的激活，对胚胎进行了筛选，使其具备较强的抗冷冻损伤能力及解冻复苏率高的特点。且囊胚移植缩短了胚胎植入宫腔后，进一步发育与着床之间的时间间隔，使子宫内膜与胚胎发育更趋于同步，更符合自然的生理现象。何况该阶段子宫收缩频率降低，更减少了胚胎被排出体外的概率。近年来，越来越多的中心开始选择单囊胎移植。目前关于囊胚期移植是否能降低异位妊娠率，仍有一定的争论[5-6]，迄今为止的数据尚无足够的统计学证据能表明，囊胚移植可以降低异位妊娠的风险。为此，本研究不能为了避免异位妊娠而针对选择囊胚移植。
二、内膜准备方案
子宫内膜准备是FET环节中的一个非常重要的方面。有学者[7]研究发现，跟鲜胚移植周期相比，FET周期的种植率、妊娠率均增高，差异有统计学意义。冻融胚胎移植可能是将来胚胎移植的趋势。目前FET子宫内膜的准备方案有多种，本研究选择最常用3种(激素替代周期和自然周期、微刺激周期)，本研究3组生化妊娠率、临床妊娠率、早期流产率无差异。异位妊娠激素替代组3例，自然周期与微刺激组0例，这可能与激素替代组样本容量大，而自然周期与微刺激组样本容量少有关。
自然周期被广泛认可的子宫内膜准备方案简单、经济，在排卵后使用的黄体支持用量不大，患者可选择口服黄体酮制剂，避免了长期肌注黄体酮带来的不便。且自然周期准备的子宫内膜状态也是最符合生理要求的。本中心行自然周期方案增加患者来院次数，超声检查频繁，若出现卵泡发育不良时，会更换为微刺激周期或者直接取消周期；若监测卵泡发育时，发现内膜厚度太薄，也会取消周期，因此周期取消率较高。本研究发现，自然周期组准备的子宫内膜厚度明显厚于其他两组，与El-Toukhy等[8]和李豫峰等[9]报道一致，可能与激素替代组多为雌激素水平低下的无排卵患者，或因自然排卵周期内膜始终菲薄而改用激素替代有关；自然周期组内膜转化日雌二醇低于其他两组，可能与激素替代周期使用芬吗通阴道用药与微刺激方案多卵泡发育导致血清雌激素水平升高有关。
选用激素替代方案的这类患者无自然排卵或排卵时间不易掌握。本方案通过模拟生理内膜，来确定胚胎种植窗。本中心选用的芬吗通是微粒化雌二醇，它是从植物中提取的天然雌激素，与传统的雌激素类制剂如补佳乐相比，不需要经过肝脱除戊酸基就能作用于雌激素受体，与人体内的活性雌激素结构完全相同。既可口服也可用于阴道用药。部分患者口服药物后，内膜仍较薄时，增加每天1 mg阴道用药，可以有效地增厚子宫内膜，可能跟小剂量雌激素能达到较高血清雌激素水平，上调雌激素受体的表达，提高子宫内膜容受性有关。有文献报道，芬吗通阴道用药可以更有效地增加其在子宫中的浓度，且能减少全身用药引起的乳房胀痛等不良反应[10]。本研究也发现，激素替代周期组经口服或者合并阴道联合用药后，至内膜转化日内膜厚度与其他组基本持平，且获得了最高的临床妊娠率。提示联合用药在改善内膜厚度的同时，也很可能改善了子宫内膜的容受性[10] 。国内耿嘉瑄等[11] 研究认为，冻融胚胎移植中行人工周期内膜准备，尤其是内膜偏薄者，使用芬吗通可获得与自然周期内膜准备相似的结果。也有研究表明，激素替代周期对妊娠结局和新生儿无明显影响,近期内是安全的[12]。该方案为部分子宫内膜薄的患者提供胚胎移植进而妊娠的机会。但仍有小部分患者子宫内膜薄，无法通过此方法获得较为理想的内膜，这就需要临床工作者去摸索更有效的方法。且该方案用药费用高，药物对身体的负荷也较重，个别患者出现药物不良反应。小部分患者的依从性较差，漏服药物的情况偶有发生。本中心小部分患者也因出现自发性排卵而取消周期。
微刺激对于月经周期偏长，激素替代周期子宫内膜生长过薄的患者，选用该治疗方案。本研究选用来曲唑及HMG应用于促排卵后很好地解决了以上的问题。来曲唑是非甾体类第3代芳香化酶抑剂，通过抑制体内雄激素向雌激素转化，从而降低雌激素水平，经过负反馈机制，使垂体分泌促性腺激素而刺激卵泡发育，与克罗米芬相比，其多为单一卵泡发育，排卵率高，OHSS发生低，特异性高，其半衰期短，对子宫内膜影响小，不消耗雌激素受体，从而保证子宫内膜对卵泡晚期高水平雌激素有良好的反应，排卵时内膜能达到胚胎种植所需要的厚度。直接肌注HMG却可导致多个卵泡发育而增加OHSS的风险。这是内膜转化日雌二醇明显高于自然周期的主要原因。有研究报道[13-14]微刺激组与其他两组的临床结局比较无差异，这与本研究结论相一致。虽然与其他两组相比，生化妊娠率、临床妊娠率无差异，但其生化妊娠率、临床妊娠率还是有增高趋势，对于自然周期FET失败者，也可考虑选择来曲唑促排卵周期。但因费用比自然周期[15]相对较高，且有发生卵巢过度刺激可能，故本中心选用该方案的例数较少。
三、总结
本研究结果提示3种子宫内膜准备方案不影响冻融周期胚胎移植的结局。临床上应结合每个患者的具体情况，选择合适的方案进行FET。冻融周期采用单囊胚移植均能获得较高的临床妊娠率。囊胚培养是一项增加胚胎选择效率的技术，而胚胎本身并不能从延长培养中受益[16]。对于延长体外培养时间导致胚胎产生的应激损伤和对后代的健康是否有长远影响，也是大家一直所关注的话题。
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