胚胎自然终止的流产称为自然流产。在所有临床确认的妊娠中，自然流产的发病率占全部妊娠的15%～20%[1]，多数为早期流产,妊娠在12周前终止者称早期流产。稽留流产又称过期流产 ,即胚胎或胎儿已死亡滞留在宫腔内尚未自然排出者,是自然流产的一种特殊类型。传统的细胞遗传学核型分析结果认为，50%～70%的自然流产绒毛标本存在细胞遗传学异常[2]。绒毛细胞是胚胎外胚层细胞，具有与胚胎组织相同的遗传物质，利用绒毛细胞检测胚胎染色体异常是细胞遗传学研究的主要方法。本文对124例稽留流产患者绒毛染色体进行检测，并统计分析检测结果，探讨绒毛染色体检测在分析稽留流产原因及优生优育指导中的价值。
对象与方法
1.对象：选取2012年6月—2014年12月本院生殖中心及计划生育中心就诊的稽留流产者124例，要求进行绒毛染色体分析，临床上排除夫妻双方染色体异常、免疫异常、内分泌及感染等影响因素。根据末次超声测定的孕囊及胚芽大小，估算胚胎停止发育的孕周为9～13周，孕妇年龄21～40岁。
2.标本处理：对胚胎停育孕妇交待病情并签署知情同意书，进行血、尿常规，肝功能、传染病等相关检查正常后行吸宫术。术中将绒毛吸入无菌吸管，将绒毛组织取出并经无菌生理盐水漂洗，送遗传室进行绒毛染色体分析检测。
3.绒毛细胞培养及核型分析：在超净台上挑取绒毛组织10～20 mg，剪碎后加入绒毛膜细胞处理试剂(杭州宝荣)，置于37 ℃水浴箱中振荡消化10 min,1500 r/min,弃上清，加入5 ml培养液，震荡均匀后接种于25 cm2培养瓶中，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养8～14 d，当细胞生长至60%～80%密度且分裂旺盛时，加0.1 g/ml秋水仙素处理并继续培养4～5 h，在倒置显微镜下观察到有较多分裂相时，加入0.25%胰酶消化培养瓶中的细胞,吸入离心管离心后留沉淀加入0.075 mol/L KCl,混匀后于37 ℃水浴锅中低渗20 min，加入1 ml固定液(冰醋酸∶甲醇=1∶3)预固定3 min，离心后弃上清，加入6 ml固定液固定20 min，离心后弃上清，加入6 ml固定液再固定20 min，离心后弃上清，视管底细胞量适当加入几滴固定液，滴片后于75 ℃烤箱烘烤3 h，G显带后光学显微镜下2人双盲分析，观察30个中期分裂相，分析5个核型，出现嵌合体计数100个分裂相。BEIONV 4.20染色体核型分析系统拍照保存。
结果
对124例稽留流产患者行绒毛染色体检测，其中122例标本细胞生长状态理想，可行核型分析，有2例标本细胞生长状况不满足制备染色体要求，成功率为98.4%(122/124)。在培养成功的122例染色体核型分析中，检出正常核型53例，异常核型69例，核型异常率为56.6%(69/122)。在异常核型中有64例为数目异常，占异常核型的92.8%(64/69)；5例为结构异常，占异常核型率的7.2%(5/69)。数目异常中以染色体三体居多，占异常核型率的53.1%(34/64)，其次为三倍体21.9%(14/64)、性染色体单体15.6%(10/64)、四倍体6.3%(4/64)、常染色体单体3.1%(2/64)，见表1。
表1 122例稽留流产患者胎儿绒毛染色体异常染色体类型及例数
讨论
近年来，在本院生殖中心及计划生育中心就诊的孕妇自然流产率呈逐年上升趋势，流产使患者心理和生理都承受了较大的压力，也对患者家庭带来极大的痛苦。因此，开展对绒毛染色体的核型分析检查具有极其重要的现实意义[3]。本院新生儿疾病筛查中心遗传室通过对稽留流产胎儿绒毛染色体进行细胞遗传学诊断检查，及时了解本次流产原因，并为指导下一次妊娠提供可靠参考依据。绒毛滋养层细胞由受精卵有丝分裂而来，与胚胎细胞具有相同的生物遗传学特性且具有旺盛的分裂增殖能力，通过体外培养可获得大量符合细胞学实验要求的细胞，是胎儿染色体检测的理想材料。自1983年意大利学者Simoni等首次使用绒毛滋养层细胞直接制备染色体对胎儿染色体疾病进行早期快速诊断以来，该技术得到了长足的发展，现在对绒毛细胞体外培养方法主要包括直接培养法、长期培养法、悬浮培养法等，其中经长期培养法所制备的染色体在质量和数量上均能较好的满足要求。本中心通过长期培养法对124例绒毛组织的处理，除了2例标本的生长状况不满足染色体制备要求外，其余122例标本绒毛细胞均获得了良好的生长，获得了高质量的染色体分裂相。在绒毛细胞的培养过程中，绒毛细胞不被污染是其他一切工作的前提。在本中心的工作中，医务人员每一步都严格遵守无菌操作的要求，在绒毛细胞取材过程中，采用在B超引导下对孕周为9～13周胚胎停育孕妇进行清宫术，通过真空负压方法将绒毛组织吸入无菌管，然后在超净台中漂洗分离绒毛组织，这样能很好地避免绒毛组织被污染的情况发生，最大程度地保证绒毛细胞健康生长。
稽留流产的影响因素有多种，包括遗传因素、内分泌因素、免疫因素、感染因素、环境因素及精神心理因素等，其中遗传因素尤其是染色体异常是其主要原因[4]。本文中的染色体异常率为56.56%，与相关文献报道相似。染色体异常包括数目异常和结构异常。本文对染色体异常核型结果分析发现，异常核型中以染色体数目异常为主，只有5例为结构异常核型，且这5例结构异常核型中有3例伴有染色体数目异常，由此可见，染色体数目异常可能是导致胚胎稽留流产的最主要原因。染色体的非整倍体是造成胚胎底着床率和丢失的一个重要原因。染色体数目异常的胚胎遗传缺陷大，导致遗传物质不平衡，致死性高[5]。在染色体数目异常中，染色体三体最常见，本文结果与其他文献报道相似[6]。导致这一现象的主要原因是生殖细胞在减数分裂时染色体出现不分离,这种染色体数目畸变的主要发生源自双亲之一方的配子形成时或妊娠初期受精卵卵裂时出现了某号染色体不分离，则导致该染色体增多或减少一条，亦即导致三体性或单体性[7]。在本研究中三体34例，占异常核型率的49.3%，其中16三体最常见(10例)，15三体有5例，22三体有4例。有文献报道三体出现最高的染色体依次为16、21、18、13、15、22号，本研究与文献报道类似[8]。在本研究中出现2例常染色体单体，核型分别为45,XY,-18、45,XX,-21，这种常染色体丢失的情况比较罕见，是一种致死性染色体异常，90%都在胚胎期流产[9]。在本研究中出现了10例性染色体单体(45,XO)样本，该染色体异常不仅见于流产儿，且在儿童和成人中也很常见，其中存活的儿童及成人都为
Turner综合征患者。三倍体染色体异常也比较常见，在本研究中共出现了14例，主要核型为6例(69,XXY)和7例(69,XXX)，仅有1例(69,XYY)，这与文献报道的三倍体(69,XYY)较少见的情况相符[10]。
综上所述，胚胎染色体异常是稽留流产的主要原因。对于临床上稽留流产患者应行绒毛培养并对胚胎细胞进行细胞遗传学分析，及时明确稽留流产原因并做出遗传判断，为稽留流产患者下一步治疗及下一次妊娠提供充足的参考依据，从而最终达到优生优育的目的。
参考文献
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2 Sierra S,Stephenson M.Genetics of recurrent pregnancy loss.Semin Reprod Med,2006,24:17-24.
3 Foyouzi N,Cedars MI,Huddleston HG.Cost-effectiveness of cytogenetic evaluation of products of conception in the patient with a second pregnancy loss.Fertil Steril,2012,98:151-155.
4 郭楠,刘雨生,周桂香,等.129例自然妊娠与ART术后妊娠早期流产胎儿绒毛染色体核型分析.安徽医科大学学报,2013,48:163-166.
5 陆国辉.产前遗传病诊断.广州:广东科技出版社,2002:179.
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7 肖青,泰爽,符芳,等.134例首次稽留流产患者的胎儿绒毛染色体分析.中华临床医师杂志(电子版),2012,6:792-793.
8 Stephonson MD,Awartani KA,Robinson WP.Cytogenetic analysis of miscarriage from couples with recurrent miscarriage:a case-control study.Hum Reprod,2002,17:446-451.
9 Carp H,Toder V,Aviram A.Karyotype of the abortus in recurrent miscarriage.Fertil Steril,2001,75:678-682.
10 Lakovschek IC,Streubel B,Ulm B.Natural outcome of trisomy 13,trisomy 18 and triploidy after prenatal diagnosis.Am J Med Genet A,2011,155A:2626-2633.