体外受精胚胎移植(IVF-ET)的成功与胚胎质量和子宫内膜容受性相关[1]。常用评估子宫内膜容受性的指标是超声下子宫内膜厚度及类型的测量。有学者提出子宫内膜厚度可作为评估IVF-ET的结局指标，与胚胎着床率及临床妊娠率紧密相关[1-3]。临床常用改善子宫内膜厚度的方法有促性腺激素释放激素激动剂、磷酸二脂酶5抑制剂(如万艾可等)，芬吗通、小剂量阿司匹林、生长激素和中药及宫腔搔刮术等，它们可部分促子宫内膜生长，但对提高临床妊娠率无作用[4-5]。
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是由骨髓细胞及其基质、成纤维细胞、内皮细胞、单核细胞和巨噬细胞产生的具有造血干细胞特性的细胞因子，通过与其特异性受体相结合而刺激骨髓嗜中性粒细胞增殖分化及其在外周血中的释放。有学者提出其特异性受体除了能够被原始造血细胞表达，内皮细胞、滋养细胞、胎盘细胞和颗粒细胞也可以表达。宫腔内灌注G-CSF作为一种新型促子宫内膜生长免疫治疗方式，有学者通过动物和人体试验发现G-CSF可促进子宫内膜生长、提高ART周期临床妊娠率[6-7]。也有学者提出宫腔内G-CSF灌注并不能促子宫内膜生长，与IVF-ET周期的临床妊娠率也无相关性。还有部分学者提出长期应用G-CSF可促进肿瘤细胞新生血管形成，拮抗化疗药物对肿瘤细胞的作用[8]。本研究的主要目的是采用Cochrane系统评价的方法对宫腔内G-CSF的临床有效性疗效进行评价，为G-CSF的广泛临床应用提供一定依据。
资料与方法
一、资料收集
计算机检索Cocharane Library、PubMed、Google、中国期刊全文数据库和万方数据库。中英文检索词为granulocyte colony stimulating factor、G-CSF、pregnancy rate、 implantation、endometrium、IVF-ET、G-CSF、妊娠率、子宫内膜厚度、IVF-ET、随机对照；手工检索《生殖与避孕》、《实用妇产科杂志》、《现代妇产科进展》等国内相关专业杂志。
二、方法
1.研究文献的纳入和排除标准：(1)纳入标准。①公开发表；②入选受试者IVF-ET周期均为新鲜胚胎移植或冷冻胚胎移植；③以G-CSF为干预措施，设对照组；④记录有研究开展或发表年限，结果记录清楚，可以合并的相关文献；⑤英文和中文；⑥随机对照实用设计。(2)排除标准。①排除半随机或非随机对照实验；②文献未涉及对照或自身对照，实验组及对照组基线分析有明显差异或未做基线分析；③重复报道；④结果不能合并；⑤非中英文文献；⑥描述不全，索要相关数据，作者未回复及提供的文献；⑦不能提取统计学数据的文献，如综述、系统评价、会议报告等。
2.文献质量评价：由2位研究者按照纳入标准对相关文献仔细阅读，在文献取舍及试验数据方面持不同观点时，则需进行讨论决定，必要时由第3名研究者裁决。偏倚风险估计按照Cochrane协作网指南要求进行评价，评价项目包括随机分组、分配隐藏、盲法、数据缺失、意向性分析及其他风险。各个特定偏倚风险分为低、高风险及风险不明。
3.资料提取：病例特点、研究方案、疗效判定指标及结果等。
4.统计学处理：采用Cochrane 协助网提供的RevMan5.3版统计软件进行数据分析，结果一般为分类变量和数值变量表示，固定模型计算分类变量比值比(OR)和95%可信区间(95% CI)，95% CI为exp[In(OR)±1.96×sx(InOR)]，sx为OR的标准误；数值变量均采用加权均数差(WMD)。统计结果记录，对无异质性的研究结果(P>0.1，I2<50%)采用固定效应模型合并效应量，反之存在异质性的则采用随机效应模型分析，计算合并的OR值并给出相应的95% CI描述。
结 果
初检出102篇文章，通过阅读及摘要初筛纳入28个研究，进一步阅读全文后最终纳入5个研究[9-13]，共599例患者(图1)。此5篇文献均为随机对照实验。1篇纳入文献研究对象为非薄型子宫内膜[13]；1篇文献探索的是IVF周期不同时段宫腔内G-CSF灌注对子宫内膜厚度的影响[11]，其余3篇文献以常规促子宫内膜生长治疗联合宫腔内灌注G-CSF为治疗组，常规促子宫内膜生长治疗为对照组进行比较[9-10,12]。见表1。
表1 纳入研究文献基本情况
一、 纳入研究的方法学质量评价
纳入研究的文献均有明确的纳入及排除标准。其中有3项研究未描述具体的随机方法，因此有选择性偏倚的轻度可能性。有4项研究未描述分配隐藏，其余1项研究正确使用密封信封，因此有轻度实施偏倚的可能。1项研究使用了盲法[13]，4项均未描述[9-11,12]，可能存在测量性偏倚。5项研究均无失访，故无损耗性偏倚。这次系统评价纳入的文献研究代表性尚可。见图1。
二、 疗效评价
1.临床妊娠率：5篇文献均描述了临床妊娠率的比较，共纳入患者599例，其中行宫腔内G-CSF灌注组287例，对照组312例。研究间无统计学异质性(P=0.15，I2=40%)，I2<50%，故采用固定效应模型进行系统评价。Meta分析结果显示，[OR=1.87,95%CI(1.32～2.66),P=0.0004]。见图2。
2. 由于纳入文献中常规促子宫内膜生长方式的应用，为了排除其他干预因素及进一步探索宫腔内G-CSF灌注对临床妊娠率的影响，本研究进行了分组分析。共纳入患者447例，其中行宫腔内G-CSF灌注组189例，对照组258例。研究间无统计学异质性(P=0.72，I2=0%)，I2<50%，故采用固定效应模型进行系统评价。Meta分析结果显示，[OR=2.29,95%CI(1.51～3.46),P<0.0001]。见图3。
3. 子宫内膜增长 5篇文献中有4篇描述了宫腔内G-CSF灌注前后内膜变化，共纳入患者401例，其中行G-CSF宫腔内灌注组192例，对照组209例。各研究选用相同指标测量且无统计学异质性(P=0.30，I2=19%)，I2<50%，故采用加权均数差及固定效应模型合并效应量进行系统评价。Meta分析结果显示，两组间在子宫内膜厚度变化方面差异有统计学意义，G-CSF可以促进子宫内膜生长方式[MD=0.68,95%CI(0.27～1.08)，Z=3.28, P=0.001]。见图4。
4.进一步比较G-CSF促子宫内膜增长的有效性，联合常规促子宫内膜增长方式较常规方法比较，共纳入患者260例，其中宫腔内灌注G-CSF联合常规治疗组119例，常规治疗组141例。各研究间选用相同指标测量且无统计学异质性(P=0.58，I2=0%)，I2<50%，故采用加权均数差和固定效应模型进行系统评价。Meta分析结果示，两组间促子宫内膜厚度差异有统计学意义，G-CSF联合常规方式可促进子宫内膜生长方式[MD=0.87,95%CI(0.54～1.19)，Z=5.25, P<0.00001]。见图5。
图1 文献筛选流程图
图2 宫腔内G-CSF灌注后临床妊娠率比较的森林图
图3 宫腔内G-CSF灌注合并常规促子宫内膜内膜方式对临床妊娠率比较的森林图
图4 宫腔内灌注G-CSF与常规促子宫内膜增长比较森林图
图5 宫腔内灌注G-CSF联合常规促子宫内膜生长与常规促子宫内膜生长增长森林图
讨 论
G-CSF作为一种新型免疫治疗方式，其是否能在辅助生殖技术中促子宫内膜生长和提高临床妊娠率尚存争议[6,14]。2011年Gleicher等[15]首先试验性对4名33～45岁薄型子宫内膜助孕患者行宫腔内灌注300 ug/ml重组G-CSF，结果发现所有患者均成功妊娠，除了一名患者为异位妊娠，初步提出宫腔内灌注G-CSF可提高临床妊娠率。为了进一步证实G-CSF可提高薄型子宫内膜助孕患者临床妊娠率，该作者加大样本量(n=21)，但该纳入对象平均年龄为(40.5±6.5)岁并有部分患者(16/21)已诊断为卵巢储备功能下降，研究结果显示宫腔内灌注G-CSF可促进子宫内膜增长，临床妊娠率维持在19.1%的提高，考虑患者年龄降低卵巢反应性并影响卵巢功能有关[16]
接着Kunicki等[17]纳入37例薄型子宫内膜(En<7 mm)助孕患者，于hCG日宫腔内灌注G-CSF 150 mg/ml，72 h后超声下测量子宫内膜厚度变化，移植后30d后追踪临床妊娠情况(超声下探及宫腔内孕囊，并可见心管搏动)，结果表明此次队列研究临床妊娠率为18.9%(7/37)，子宫内膜厚度在灌注后72h均明显增加(无论是否成功妊娠)，但差异无统计学意义。同时Li等[12]回顾性对照研究探索FET周期薄型子宫内膜(En<7 mm)患者行宫腔内灌注G-CSF对子宫内膜厚度及临床妊娠率的影响。纳入试验组(n=34)100 ug/0.6 ml宫腔内灌注，对照组(n=25)空白对照，行FET后30d追踪发现两组临床妊娠率差异无统计学意义；试验组子宫内膜厚度在灌注后72h和对照组比较无明显改善。Barad等[13]探索宫腔内灌注G-CSF对正常子宫内膜厚的影响，纳入141例研究对象。首先根据移植周期分为新鲜周期(n=129)和FET周期(n=12)，再随机分为干预组(n=73)，干预组宫腔内灌注G-CSF 300ug/ml和对照组(n=68)宫腔内等量生理盐水灌注，结果发现两种助孕方案宫腔内灌注G-CSF均不能促进正常子宫内膜生长，也不能提高临床妊娠率。但此研究结论与该学者之前提出宫腔内灌注G-CSF可促进薄型子宫内膜生长及提高临床妊娠率相矛盾[15-16]，
国内学者哈灵侠等[9]比较宫腔内灌注G-CSF联合常规促子宫内膜生长方式(激素替代法)与激素替代法对薄型子宫内膜和临床妊娠率的影响，结果发现两组均可促子宫内膜生长，但宫腔内灌注G-CSF联合激素替代组内膜厚度明显增加，可有效增加子宫内膜血流灌注改善子宫内膜容受性，且激素替代联合宫腔内灌注G-CSF组有更高临床妊娠率[35.4%(28/79)vs 22.0%(22/100)，P=0.04]，差异有统计学意义。但该学者提出不能排除G-CSF的临床有效性是否与激素替代和G-CSF的协同作用有关。Li等[12]评估G-CSF对薄型子宫内膜的有效性,共纳入82例研究对象，首先进行宫腔内灌注G-CSF前后对照，结果发现宫腔内灌注G-CSF后子宫内膜厚度明显增加[(5.7±0.7)mm vs( 8.1±2.1)mm，P<0.001]，临床妊娠率较对照组高(48.1% vs 25.0%，P=0.038)，然后进行G-CSF组亚型比较,G-CSF组和G-CSF联合宫腔内搔刮组，结果显示两亚组间子宫内膜厚度增长无明显差异，G-CSF联合宫腔内搔刮组较单独应用G-CSF组临床妊娠率高，但差异无统计学意义(53.8% vs 42.9%，P>0.05)。高明霞等[11]学者进一步探讨宫腔内灌注G-CSF对子宫内膜容受性的影响进行前瞻性研究，将纳入对象随机分成G-CSF组(n=60)行IVF-ET前进行1～6次宫腔内灌注G-CSF，对照组(n=30)则不给予G-CSF，结果发现G-CSF组在早卵泡期、晚卵泡期子宫内膜厚度均较对照组增加，差异有统计学意义,围排卵期G-CSF组较对照组子宫内膜厚度的增长幅度大，但两者间差异无统计学意义,在已行ET患者中，G-CSF组妊娠率为62.5%(35/56)，对照组妊娠率为33.3%(9/27)，差异具有统计学意义。在本研究中，为了减少纳入文献的异质性，故仅将该文献围排卵期子宫内膜厚度的变化纳入，且纳入时间为宫腔内灌注G-CSF后96h子宫内膜厚度的变化。
宫腔内灌注G-CSF可促进ART周期中子宫内膜增长、提高临床妊娠率。但本研究结果进一步证实宫腔内灌注G-CSF联合常规促子宫内膜生长方式可显著促子宫内膜增长、提高临床妊娠率。综上所述，考虑与宫腔内灌注G-CSF的以下作用有关：如增加子宫内膜血流；激活内分泌 -旁分泌作用途径，诱发多种内源性细胞因子分泌；调节子宫内膜蜕膜化,促进子宫内膜细胞增殖；改善子宫内膜对雌激素及血管活性物质的抵抗，可一定程度治疗子宫内膜炎；通过唤醒子宫内膜干细胞修复子宫子宫内膜；调节母胎间的免疫平衡等影响内膜容受性和胚胎种植，但其具体机制尚需进一步研究。
本研究meta分析的不足之处在于：经过RCT检索后符合纳入标准文献较少；2014年国外学者已经进行反复自然流产后宫腔内灌注G-CSF的meta分析，故本文献仅仅纳入RCT文献进行分析；纳入文献质量有待提高。尚需进一步临床RCT研究后分析。
参考文献
1 Zhao J,Zhang Q,Li Y.The effect of endometrial thickness and pattern measured by ultrasonography on pregnancy outcomes during IVF-ET cycles.Reprod Biol Endocrinol,2012,10:100.
2 Amir W,Micha B,Ariel H,et al.Predicting factors for endometrial thickness during treatment with assisted reproductive technology.Fertil Steril,2007,87:799-804.
3 Uzumaki H,Okabe T,Sasaki N,et al.Identification and characterization of receptors for granulocyte colony-stimulating factor on human placenta and trophoblastic cells.Proc Natl Acad Sci U S A.1989,86:9323-9326.
4 孙旸,梁婧,兰晓霞，等.改善子宫内膜发育不良的药物治疗.国际生殖健康/计划生育杂志,2015:251-254.
5 雷福珍.宫腔内灌注粒细胞集落刺激因子治疗薄型子宫内膜的临床观察.当代医学,2015:28-29.
6 Ziebe S,Loft A,Povlsen BB,et al.A randomized clinical trial to evaluate the effect of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) in embryo culture medium for in vitro fertilization.Fertil Steril,2013,99:1600-1609.
7 Xu B,Zhang Q,Hao J,et al.Two protocols to treat thin endometrium with granulocyte colony-stimulating factor during frozen embryo transfer cycles.Reprod Biomed Online,2015,30:349-358.
8 Root RK,Dale DC.Granulocyte colony-stimulating factor and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor:comparisons and potential for use in the treatment of infections in nonneutropenic patients.J Infect Dis.1999,179:S342-352.
9 哈灵侠,袁莹莹,裴利国,等.粒细胞集落刺激因子宫腔灌注在改善薄型子宫内膜中的应用价值.中国妇幼保健,2015:82-85.
10 何峻,陈朝军,周桦.粒细胞集落刺激因子治疗反复胚胎种植失败患者的研究,实用临床医学,2015:64-7.
11 高明霞,陈思同,李丽斐,等.人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)宫腔灌注改善子宫内膜容受性的临床研究.生殖与避孕,2014,34:527-533.
12 Li Y,Pan P,Chen X,et al.Granulocyte colony-stimulating factor administration for infertile women with thin endometrium in frozen embryo transfer program.Reprod Sci,2014,21:381-385.
13 Barad DH,Yu Y,Kushnir VA,et al.A randomized clinical trial of endometrial perfusion with granulocyte colony-stimulating factor in in vitro fertilization cycles:impact on endometrial thickness and clinical pregnancy rates.Fertil Steril,2014,101:710-715.
14 Cavalcante MB,Costa FS,Barini R,et al.Granulocyte colony-stimulating factor and reproductive medicine:A review.Iran J Reprod Med,2015,13:195-202.
15 Gleicher N,Vidali A,Barad DH.Successful treatment of unresponsive thin endometrium.Fertil Steril,2011,95:2113-2123.
16 Gleicher N,Kim A,Michaeli T,et al.A pilot cohort study of granulocyte colony-stimulating factor in the treatment of unresponsive thin endometrium resistant to standard therapies.Hum Reprod,2013,28:172-177.
17 Kunicki M,Lukaszuk K,Woclawek-Potocka I,et al.Evaluation of granulocyte colony-stimulating factor effects on treatment-resistant thin endometrium in women undergoing in vitro fertilization.Biomed Res Int,2014,2014:913235.