自发性流产(spontaneous abortion)为妇产科领域常见疾病，发生率占全部妊娠的10%～15%[1]。引发自然流产的因素很多，其中遗传因素，尤其染色体数目异常是导致自然流产发生的主要原因，占到所有致病因素的50%～60%[2-4]。染色体数目异常与着丝粒结构和功能异常、纺锤体检查点缺陷、端粒异常等因素有关。其中染色体着丝粒蛋白的异常表达可引发细胞过程中染色体不分离或分离异常，这是导致数目异常染色体的重要因素[4]。着丝粒蛋白-H(centromere protein-H，CENP-H)是目前已知的着丝粒点基本及特异的组成成分，与CENP-A及CENP-C共同定位在染色体着丝粒点的内盘上，存在于整个有丝分裂中期和分裂间期，在染色体的分离过程中发挥重要作用[5]。本文通过比较自然流产患者中染色体异常组与染色体正常组胚胎绒毛组织中CENP-H的表达差异，旨在初步探讨自发性流产的遗传及分子生物学机制，为寻找自然流产的早期诊断指标及检测方法提供前期理论及实验依据。
对象与方法
一、对象
选取2014年1月—2015年1月于山西省妇幼保健院生殖医学中心就诊的早期自然流产患者96例为研究对象，孕妇年龄在21～45岁，平均年龄(31.7±4.3)岁；妊娠天数为44～85 d，平均(58.3±11.4)d。患者经超声检查均为宫内受孕， hCG尿检均呈阳性。夫妻双方染色体核型检查正常，家族中无遗传病史，夫妻双方均无有害及毒性物质接触史，排除生活或环境因素有污染、酗酒、吸烟的患者。研究对象均取得本人同意且签署知情同意书，并由医院伦理委员会讨论通过。
二、方法
1.标本采集：通过负压吸引术，于无菌条件下获取所有患者的绒毛组织。于显微镜下去除蜕膜组织，选取适宜绒毛组织置于无菌生理盐水(5 ml)中进行反复冲洗。依据检测技术不同，将所取标本进行不同处理。部分绒毛组织经液氮速冻后，置于-80℃冰箱内进行冻存，以备PCR及Western blotting使用，其余绒毛组织经眼科剪剪碎，除去不易剪碎的绒毛组织，采用37℃水浴下低渗、固定剂(甲醇：冰醋酸=3:1)固定、冰醋酸消化1 min，经甲醇终止消化后，弃上清、固定液重悬后滴片，室温下过夜干燥后避光保存。
2.FISH检测绒毛染色体数目：室温下，将制备好的玻片置于2×SSC(pH7.0)溶液中漂洗10 min，进而经胃蛋白酶消化5 min，再将其置于2×SSC溶液中漂洗5 min，随后经70%、85%、100%乙醇脱水各3 min。选用GLP13/GLP21位点、GLP16/GLP22位点及CSP18/CSPX/CSPY着丝粒探针(北京金菩嘉医疗科技有限公司)于42℃水浴锅中杂交16 h。经洗涤液漂洗后，于避光条件下复染DAPI，加盖盖玻片。于荧光显微镜下随机计数细胞信号50个，单独判断每种检测指标，90%以上的细胞显示正常信号提示正常，60%以上的细胞显示异常信号提示异常，若结果介于两者之间则扩大计数至100个细胞以决定最终结果。染色体异常率=(染色体异常例数/总病例数)×100%，占染色体异常发生数比例=(染色体异常例数/总染色体异常例数)×100%。
3.Real-time PCR检测自然流产胚胎绒毛组织CENP-H mRNA相对表达量：采用实时荧光定量PCR(RT-QPCR)法，对逆转录的cDNA浓度进行PCR扩增。以β-actin作为内参，并优化反应条件，使目的基因与内参的扩增效率近似相等且接近100%，Ct值代表基因的起始拷贝数，可根据Ct值比较基因的表达量。ΔΔCt =(Ct目的基因Ct内参基因)(Ct阴性对照Ct内参基因)，以2-ΔΔCt计算各组mRNA的相对表达量。基因引物序列为CENP-H上游5’-TGCAAGAAAAGCAAATCGAA-3’，下游5’-ATCCCAAGATTC CTGCTGTG-3’；β-actin上游5’-TGTACGTTGCTATCCAGGCT-3’，下游5’-CTCCTTA ATGTCACGCACGA-3’，所有引物均由上海Invitrogen生物工程有限公司合成。
4.Western blotting检测自然流产胚胎绒毛组织CENP-H蛋白表达水平：胚胎绒毛组织内的蛋白提取，需将绒毛组织研磨后用PBS洗涤3次后用蛋白提取试剂盒(凯基)提取，随即测定蛋白浓度，与蛋白上样缓冲液以5：1体积混合，于100℃开水中煮10 min。随后用SDS-PAGE胶对胚胎绒毛组织提取的蛋白进行电泳分离，采用半干转膜，用5%的牛奶封闭液对聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜进行封闭1 h，随后加入CENP-H的多克隆一抗(Proteintech公司)于4℃摇床孵育过夜。辣根过氧化物酶标二抗(康为世纪)孵育2 h后，加入化学发光剂曝光。各组以β-actin为研究内参，比较各组胚胎绒毛组织中蛋白的相对表达水平。
5.统计学处理：应用SPSS 17.0统计软件，计量资料用
标准差表示，组间采用t检验，计数资料用率表示，采用χ2检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、胚胎绒毛染色体数目分类
96例流产患者绒毛标本的FISH检测成功率为100%，其中染色体正常53例；检出染色体异常发生总数为43例，异常率为44.8%，其中常染色体数目异常26例，异常率为27.1%，性染色体数目异常10例，异常率为10.4%，性染色体合并常染色体异常3例，异常率为3.1%，三倍体及四倍体各2例，其异常率均为2.1%，详见表1。
二、胚胎绒毛CENP-H基因 mRNA 相对表达量的检测
用实时荧光定量PCR检测两组患者胚胎绒毛组织中CENP-H基因 mRNA表达情况，相比染色体正常组，染色体异常组患者绒毛CENP-H基因 mRNA相对表达量降低，差异具有统计学意义，见图1。
三、胚胎绒毛CENP-H蛋白的表达情况
用Western-blotting检测两组患者胚胎绒毛组织中CENP-H的蛋白表达情况，结果显示与正常组相比，染色体异常组患者胚胎绒毛组织内CENP-H蛋白表达降低，差异具有统计学意义，见图2。
表1 胚胎绒毛染色体数目分类
注：40例阳性病例中有3例同时存在2种异常类型,故异常发生总数为43例。
图1 胚胎绒毛CENP-H基因 mRNA 相对表达量的检测
图2 胚胎绒毛CENP-H蛋白的表达情况
讨 论
造成自然流产的因素主要有遗传因素、免疫因素、感染因素、解剖因子、内分泌因素、男性因素及环境因素等，其中遗传因素引发的胚胎染色体异常被认为是目前已知的最常见的自然流产诱发因素[6]。研究表明，孕早期自然流产的胚胎中有50%～60%胚胎发生染色体异常，其中90%为染色体数目异常，且以16-三体最为常见，13、18、21、22-三体较少，1、5、9-三体仅有个例报道[7]。本研究结果显示44.8%早孕期自然流产胚胎中存在染色体数目异常，与国内外文献报道一致。
细胞分裂及姐妹染色体分离过程中，子细胞得到准确数目染色体的前提是染色体与纺锤体微管的正常连接，进而在纺锤体微管的牵引下，染色体逐渐向细胞两极移动且平均分配到两个子细胞中去，从而保证亲代细胞的遗传信息完整地传递给子代细胞[8]。如若在细胞分裂过程中，染色体出现不等分则将导致子细胞中染色体数目异常，进而导致先天畸形胎儿甚至自发性流产[8-9]。着丝粒的结构和功能的正确行使在染色体分离的过程中发挥着重要作用，在有丝分裂及减数分裂的过程中，其能与纺锤体微管结合且为染色体的运动提供动力，并能在染色体正确排列在赤道板上之间阻滞下一阶段细胞周期的进行。当着丝粒蛋白表达出现异常时，可引发着丝粒组装异常及无法正确行使其功能，进而导致子细胞染色体的数目异常或抑制细胞分裂的正常进行[10]。CENP-H是着丝粒内板的结构蛋白之一，其存在于整个有丝分裂中期和分裂间期，与CENP-A及CENP-C共同组成活性着丝粒复合体的功能性组件，在染色体的分离中发挥着重要作用。有研究发现当CENP-H表达异常时，会引发染色体排列异常、多级纺锤体以及非整倍体的发生[11-12]。
本文发现染色体异常组患者的CENP-H蛋白的表达较染色体正常组患者显著降低，证实了CENP-H基因的异常表达与胚胎绒毛细胞染色体数目异常之间存在密切联系。此结果与同类报道相一致，由于CENP-H、CENP-A及CENP-C构成的复合体可连接动力蛋白及纺锤体微板，其无论在结构上还是在功能上在细胞分裂过程中均具有重要功能。当敲除CENP-H后可导致CENP-A无法整合到动力蛋白中去，同时CENP-H对于CENP-C在染色体着丝粒点上的定位是不可或缺的。CENP-H缺失的染色体无法被纺锤体附着，进而导致在细胞分裂过程中染色体无法向两极正常移动，引发非整倍体的形成。
综上所述，本研究进一步证实了CENP-H是着丝粒结构和功能的重要调控因子， CENP-H的异常表达可引发细胞分裂过程中染色体的不分离或异常分离。由此可见，CENP-H的低表达很可能是导致自发性流产患者染色体数目异常的重要因素之一，这为进一步探索自发性流产的遗传及分子生物学机制及早期诊断指标及检测方法的探寻奠定了理论和实验基础。
参考文献
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