肌生成是胎儿期和出生后早期骨骼肌生长的主要形式。肌生成的过程包括：骨骼肌卫星细胞激活后增殖、活化变为成肌细胞；随后成肌细胞分化为肌细胞；肌细胞逐渐平行排列并相互融合形成肌管；肌管进一步分化最终形成成熟肌纤维。骨骼肌卫星细胞是位于肌细胞膜和基膜之间的具有增殖分化潜力的肌肉干细胞，在骨骼肌的生长发育过程中起重要作用[1]。程序化观点认为生命早期各种损害、刺激性或营养状态的改变会导致器官在发育、生理功能和代谢方面发生改变，这种改变一旦被程序化，将发生永久性的改变。这一时期通常是细胞的快速分裂期，也是出生前或生命早期多数组织和系统形成的关键时期，孕母营养不良、营养过剩、感染、心理创伤、吸烟、内分泌疾病等影响可造成组织或系统发育发生不可逆的改变[2]。宫内环境可影响胎儿骨骼肌的发育，有可能导致骨骼肌出现如胰岛素敏感性等不可逆的代谢改变等[3]。早产儿在宫外生活早期，相当处于胎儿宫内生长发育的妊娠期，如营养不足或失衡及处于子宫内外环境改变的应激状态，可产生类似程序化代谢改变[4]。因此，胎鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、纯化与鉴定，可进一步行体外胎鼠骨骼肌发育和干预研究。骨骼肌卫星细胞的体外培养是研究肌生成的技术关键。本研究旨在建立一种可靠稳定的原代胎鼠骨骼肌卫星细胞的分离培养方法，为胎儿和早产儿骨骼肌发育程序化的研究提供实验基础。

材料与方法

一、材料

1.实验动物：本实验经中山大学附属第一医院医学伦理委员会批准。中山大学附属第一医院动物实验中心提供SPF级Sprague-Dawley成年期大鼠，动物实验中心饲养室温度为20℃～25℃，湿度为40%～70%，昼夜周期各12 h。按雌雄大鼠1：1合笼过夜，次日晨取雌鼠阴道分泌物涂片，镜检见精子者当日记为妊娠第1天，将孕鼠分笼并于孕18 d时剖宫取出胎鼠。

2.主要试剂：DMEM/F12培养基(Hyclone公司)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(Gibco公司)，马血清(horse serum，HS)(北京索莱宝科技有限公司)，碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor， bFGF)(Bio Basic公司)，Ⅰ型胶原酶(Sigma公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，免疫组化染色试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)，DAB染色试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)，CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所)，结蛋白(Desmin)多克隆抗体(Thermo Scientific公司)，青-链霉素双抗(碧云天生物技术研究所)，D-Hank’s 液(碧云天生物技术研究所)。

生长培养基(DMEM/F12+20%FBS+10%HS+5ng/ml bFGF+1%青-链霉素双抗)、分化培养基(DMEM/F12+2%HS+1%青-链霉素双抗)。

二、方法

1.胎鼠骨骼肌卫星细胞培养及纯化：采用Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶两步消化法和差速贴壁法分离纯化胎鼠骨骼肌卫星细胞。孕 18 d时，在无菌条件下剖宫取出胎鼠，置无菌培养皿。手术显微镜下取胎鼠四肢肌肉，尽量去除脂肪、肌腱等结缔组织，4℃预冷的含抗生素Hank’s缓冲液冲洗3次。将肌肉组织剪成1 mm3左右的碎块，Hank’s缓冲液洗3次。向剪碎的肌肉中加入4倍体积0.1%Ⅰ型胶原酶消化，37℃水浴30 min，每隔10 min震荡1次，180 g离心10 min，弃上清；在沉淀中加入4倍体积0.25%胰蛋白酶，吹打混匀，37℃水浴15 min，期间每3～5 min震荡1次，然后加入等体积含20%FBS的DMEM/F12培养基终止消化，反复吹打，依次滤过100、200、400目的细胞筛网，180 g离心10 min，弃上清，生长培养基重悬细胞，台盼蓝染色计数细胞活力(≥90%方可继续实验)。将细胞悬液接种于培养皿中，37℃、5% CO2培养箱培养，2 h后倒置显微镜下观察可见部分细胞已贴壁(P1)，将上层细胞悬液转移至新的培养皿(P2)中培养，3 d后换液，待P2中的细胞长至50%～60%密度时进行消化传代，接种前进行第2次差速贴壁(1 h)，得到的细胞即为纯化后的骨骼肌卫星细胞。

2.细胞生长曲线绘制：取分离纯化的骨骼肌卫星细胞，用0.25%的胰蛋白酶进行消化传代，以104/ml密度接种于96孔板，设3个重复孔，置37℃，5% CO2培养箱中培养，24 h细胞贴壁后每孔加入 10 μl CCK-8溶液，继续于37℃，5% CO2培养箱中孵育1 h，使用酶标仪测量450 nm光密度(optical density，OD)值。每24 h进行加药、测OD值，连续7 d。以OD值的平均值为纵坐标、细胞培养天数为横坐标描绘生长曲线。

3.肌管诱导分化：待生长状态良好的骨骼肌卫星细胞长到约80%密度后，开始肌管诱导，即换用分化培养基继续培养3 d，倒置相差显微镜下观察肌管形成情况。

4.骨骼肌卫星细胞的免疫组化鉴定：取传至第2代的骨骼肌卫星细胞进行细胞爬片，待细胞增殖至70%密度时取出爬片，用SP免疫组化检测试剂盒进行免疫染色鉴定。细胞爬片用PBS缓冲液清洗后用4%多聚甲醛室温固定10 min，再用PBS液洗3遍。0.3%Triton室温下通透15 min，PBS液冲洗3次。用试剂A(山羊血清)室温封闭非特异性抗体30 min，甩去封闭血清，不用PBS冲洗，直接滴加Desmin一抗工作液(1：200稀释)，4℃过夜。PBS 液冲洗 3 次，试剂B(生物素化二抗工作液)室温下30 min。PBS 液冲洗 3 次，试剂C(辣根酶标记链霉卵白素工作液)室温下30 min。PBS 液冲洗 3 次，DAB显色，显微镜下观察，细胞出现棕黄色染色时用自来水终止显色。苏木紫复染，脱水，透明，中性树胶封片。在镜下观察，阳性细胞胞质为棕黄色，进行拍照记录，高倍镜视野随机数500个细胞，计算阳性率。成纤维细胞作为阴性对照。

结　　果

一、原代胎鼠骨骼肌卫星细胞的形态

倒置相差显微镜下观察原代培养的骨骼肌卫星细胞刚接种时为圆形，细胞较小，大小基本一致，折光性较强。台盼蓝染色显示，刚分离出来的细胞90%以上不着色，为活细胞。图1A显示，培养24 h后部分骨骼肌卫星细胞开始贴壁，部分细胞逐渐伸展，呈梭形或纺锤形，体积小、折光性强。图1B显示，48 h后骨骼肌卫星细胞基本已贴壁，细胞开始增殖，数量增多，部分细胞呈长轴平行排列，具有方向性和较强的折光性。图1C显示，72 h后细胞增殖明显，出现细胞成簇生长，骨骼肌卫星细胞逐渐伸展变为细长，细胞之间有连接成网状的趋势。至培养第5天细胞增殖速度减慢，部分细胞可出现相互融合形成肌管，如不传代，细胞出现老化，失去成肌分化能力。传代细胞的贴壁速度明显增快，接种1 h后即开始贴壁，24 h内基本完全贴壁，倒置相差显微镜下观察其形态与原代细胞类似。

二、胎鼠骨骼肌卫星细胞的生长曲线

图2显示纯化后的胎鼠骨骼肌卫星细胞的生长曲线呈“S”型。接种后1～2 d开始增殖，3 d后细胞增殖明显，呈指数增长，约第5天细胞数达最大，由于细胞密度大，生长受到接触抑制的影响，增殖速度变缓，如未及时传代，细胞开始衰老凋亡。

图2　胎鼠骨骼肌卫星细胞生长曲线

三、胎鼠骨骼肌卫星细胞的肌管诱导分化

当用生长培养基培养的原代胎鼠骨骼肌卫星细胞增殖达到70%～80%密度时，换用分化培养基继续培养以诱导肌管形成，骨骼肌卫星细胞增殖速度变缓，细胞之间出现相互融合形成肌管样结构，诱导24 h即可见较多多核长管状肌管形成，继续诱导分化可见骨骼肌卫星细胞之间进一步融合，肌管变粗变大，到72 h细胞广泛融合，可见粗大肌管形成，相互牵拉呈网状，大部分肌管均可见节律性收缩现象，见图3。

四、胎鼠骨骼肌卫星细胞Desmin免疫组化染色鉴定

Desmin抗体免疫反应阳性产物呈棕黄色，密集于细胞浆中，高倍镜视野随机数500个细胞，呈Desmin阳性反应的细胞约占92%，表明培养的细胞为骨骼肌卫星细胞，见图4A，而成纤维细胞Desmin免疫组化染色为阴性反应，见图4B。

讨　　论

原代骨骼肌卫星细胞分离培养的原理主要是釆用机械剪切法加酶消化法分离骨骼肌组织，使骨骼肌卫星细胞在肌细胞膜和基膜之间释放出来[5]。本研究采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶二步消化法，其中Ⅰ型胶原酶主要对细胞间质有消化作用而不容易损伤细胞，它可以消化肌束间的连接起到分散肌纤维的作用；而胰蛋白酶则能消化分离附在肌纤维上的肌卫星细胞，但胰酶消化超过一定限度容易损伤细胞。因此，采用酶消化法分离原代肌卫星细胞时控制消化的时间很关键，消化时间过长容易损伤细胞的活性，消化时间过短又会降低细胞的产出率，不同年龄、不同物种由于肌细胞基膜中的各种成分和比例不同，酶消化的最佳时间也各不相同[6]。文献报道采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶二步消化法分离成年大鼠骨骼卫星细胞的消化时间也不尽一致，0.1%Ⅰ型胶原酶消化的时间从30 min到90 min不等，0.25%胰蛋白酶的消化时间从15 min到60 min不等[7-10]。也有采用混合酶消化法分离肌卫星细胞，如侯士方等[11]采用0.1%的Ⅰ型胶原酶、0.25%胰蛋白酶联合消化30 min分离新生大鼠骨骼肌卫星细胞。本实验发现，对于胎鼠，0.1%的Ⅰ型胶原酶消化30 min可有效地分散肌纤维，而0.25%胰蛋白酶消化超过20 min时，胎鼠骨骼肌卫星细胞的活性受到较大的影响，接种后较多肌卫星细胞不能贴壁生长。经过反复实验摸索，本实验最后确定分离胎鼠骨骼肌卫星细胞的最佳消化时间为：0.1%Ⅰ型胶原酶消化30 min加上0.25%胰蛋白酶消化15 min，两者的结合应用可以有效地将肌卫星细胞游离出来，同时最大程度地保持细胞的活性。刚分离的细胞经台盼蓝染色细胞活性达90%以上，细胞贴壁生长良好。

刚从胎鼠四肢骨骼肌组织中消化分离出来的细胞除了肌卫星细胞之外，还含有许多非肌源性细胞，主要包括血细胞(红细胞、白细胞)和成纤维细胞。其中血细胞为悬浮细胞，不贴壁生长，可以通过常规换液除去。而成纤维细胞与肌卫星细胞均属于贴壁细胞，单纯通过换液无法除去。由于成纤维细胞等非肌源性细胞的贴壁速度要快于肌卫星细胞，故可以采用差速贴壁法去除杂细胞[12]。在刚消化分离的细胞接种早期，细胞悬液中的成纤维细胞大部分已经贴壁，而骨骼肌卫星细胞由于贴壁速度较慢，仍处于悬浮状态，此时将上层细胞培养液转移至新的培养皿中，即可以得到纯度较高的骨骼肌卫星细胞。差速贴壁的时间太短，较多的成纤维细胞尚未贴壁生长，得到的肌卫星细胞纯度较低；时间过长，得到的细胞数量少，无法满足进一步的实验要求。文献报道纯化原代大鼠肌卫星细胞采用差速贴壁的时间从2 h到6 h不等[7, 11, 13]。Averous等[14]报道经过首次差速贴壁4h和传代时进行第2次差速贴壁1h可以得到纯度达90-95%的肌卫星细胞。本实验发现，对于分离纯化原代胎鼠肌卫星细胞，经首次差速贴壁2 h和传代时进行第2次差速贴壁1h得到的肌卫星细胞的纯度可以达到90%以上，细胞数量也可以满足进一步实验的要求。

骨骼肌卫星细胞体外培养时培养液的成分对其生长具有至关重要的影响，高浓度的血清可以促进肌卫星细胞的增殖，而低浓度的血清则促使细胞之间相互融合并进一步分化成为肌管。Burton等[15]研究表明骨骼肌卫星细胞体外扩增培养时除需要常规添加FBS外，加入适量的HS可以促进细胞增殖，延缓分化。除血清之外，鸡胚提取物(chicken embryo extract，CEE)在肌卫星细胞的体外培养中也有重要的作用[12]。Danoviz等[5]认为(DMEM+20%FBS+10%HS+1%CEE)适合原代大鼠骨骼肌卫星细胞的培养。Sherwood等[16]研究显示(Ham’s F10+20% FBS+5ng/ml bFGF) 适用于小鼠原代肌卫星细胞的培养。bFGF不仅可以促进肌卫星细胞的增殖，还可以减弱卫星细胞向肌管的分化[17]。本实验结果表明，(DMEM/F12+20% FBS+10%HS+5ng/ml bFGF)培养体系适合原代胎鼠肌卫星细胞的扩增培养；而(DMEM/F12+2%HS)适合分化培养。

体外培养的骨骼肌卫星细胞的一个重要的生物学特征是成肌特性，在一定条件下肌卫星细胞之间相互融合并进一步分化形成肌管[5]。形态学方面是鉴定肌卫星细胞的一个指标。根据本实验观察，影响骨骼肌卫星细胞融合分化的主要因素有细胞的密度和培养液中血清的浓度。当培养皿中细胞的汇合度超过70%容易出现相互融合和不可逆性分化。此外，降低培养液中血清的浓度，即使细胞在低密度的情况下也容易出现不可逆分化，失去增殖能力。因此本实验在骨骼肌卫星细胞密度达到70%～80%时，换用含2%HS的分化培养基诱导分化，可见细胞间发生相互融合形成大量的肌管，由此可以从形态学上鉴定分离培养得到的是骨骼肌卫星细胞。进一步行免疫组化鉴定本研究显示Desmin在骨骼肌卫星细胞胞浆中呈强阳性表达，而在成纤维细胞中呈阴性表达。Desmin是肌肉特异性中间纤维蛋白，存在于骨骼肌、心肌以及平滑肌细胞的胞浆中，在维持肌细胞的形态和功能方面起着重要的作用[18]。Desmin是骨骼肌卫星细胞分化早期表达的肌源性标志蛋白之一，可作为鉴定骨骼肌卫星细胞为特异性的标记蛋白；而成纤维细胞等非肌源性细胞则不表达Desmin [19]。

综上所述，采用消化法和差速贴壁法分离纯化胎鼠骨骼肌卫星细胞，能够获得高活性和高纯度的具有成肌分化能力的骨骼肌卫星细胞。观察到在分化培养基的诱导下细胞分化形成具有节律性收缩特性的肌管；免疫组化鉴定结果显示细胞胞浆中肌源性标志物Desmin呈强阳性表达。成功对胎鼠骨骼肌卫星细胞进行原代培养、纯化与鉴定，可以用于进一步行体外胎鼠骨骼肌发育和干预研究，提供了胎儿和早产儿骨骼肌发育程序化研究的基础。

(图1、图3、图4见封三)

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