肥胖已经成为了一个全球化的问题，其并发症，如糖尿病、冠心病等更是长期危害人类身心健康。胎盘中肥胖相关性基因(fat mass and obesity-associated gene，FTO)是一个与肥胖及代谢性疾病相关的基因，FTO mRNA广泛分布于人类组织中，在下丘脑、骨骼肌、脂肪等组织中呈现高表达，在胎盘组织中也有所表达。近年来的研究表明FTO基因与人类体重指数密切相关[1]。FTO基因突变将会影响人类的摄食习惯，导致体重增加[2-4]。
妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)定义为妊娠后首次发现或发病的糖尿病，严重危害母婴健康。据统计，GDM患者所产胎儿中巨大胎儿的发生率高达25%～40%，其子代有发生肥胖与糖尿病的可能[5]。本文旨在探讨人类胎盘中FTO基因的表达与新生儿出生体重以及与孕妇合并GDM之间的关系。
材料与方法
1.标本来源:2013年5月—11月在中国医科大学附属盛京医院产科住院的产妇分娩的胎盘组织，产妇均为汉族，其中初产妇77例(85.6%)，经产妇13例(14.4%)；年龄22～35岁，平均年龄为 (29.3±6.0)岁；孕37～42周，平均孕周(38.7±3.0)周；产妇无吸烟史；营养状态良好；产妇孕前体重指数(BMI)在18～25之间，平均BMI(19.9±4.5)；孕期体重增加<12.5 kg，平均增加(10.4±1.2)kg；新生儿出生后状态良好，外观无畸形。收集新鲜胎盘组织共90例，依据胎儿出生体重进行分组，正常体重组20例、巨大儿组20例、小于孕龄儿组10例；合并GDM正常体重组19例、合并GDM巨大儿组21例。出生体重标准及GDM诊断标准均参考文献[5]，正常出生体重儿为2 500 g≤出生体重<4 000 g，小于孕龄儿为出生体重<2 500 g，巨大儿为出生体重≥4 000 g；妊娠24～28周采用75 g口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance rest，OGTT)筛查GDM，诊断切点为空腹血糖≥5.1 mmol/L或1 h血糖≥10.0 mmol/L或2h血糖≥8.5 mmol/L，满足任何一点血糖值即可诊断GDM。
2.实验试剂：Anti-FTO antibody[EPR6895](ab124892)(abcam公司)UltraSensitive S-P超敏试剂盒(兔)(福州迈新生物技术开发有限公司)DAB显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)。
3.标本采集：新生儿精确称重，于无菌操作下取胎盘滋养层组织大小约2 cm×2 cm×1 cm(脐带附着处至胎盘另一面中央区1/2处)，生理盐水冲洗后放入4%多聚甲醛溶液中固定72 h。标本取材，脱水，透明，浸蜡，包埋，切片，厚度5μm。本实验材料来源经盛京医院伦理委员会批准，经患者同意。
4.实验方法：SP免疫组织化学法检测FTO基因产物的表达。以人乳腺组织切片作阳性对照，以磷酸盐缓冲液(PBS)代替已知一抗作阴性对照，染色步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。
5.结果判定：免疫组化阳性染色为棕黄色，定位于细胞核。阳性细胞必须结果清晰，定位准确，背景色淡。根据阳性细胞阳性强度分为4级，无着色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，深棕色或棕褐色计3分。根据着色阳性细胞个数所占比例分为4级，无着色计0分，着色比例小于25%计1分，着色比例在25%～50%计2分，着色比例在51%～75%计3分，着色比例大于75%计4分。将以上两项计分相加，计分之和≥3分判定为阳性。在阳性表达中，得分3～4分评为低表达，5～8分评为中表达，9～12分评为高表达。
6.统计学处理：使用SPSS 19.0统计学软件，采用卡方检验及Fisher精确检验验证各组间FTO基因表达的差异。
结果
1.胎盘FTO基因的表达情况：胎盘FTO基因在各组中均有阳性表达，相比正常体重组，胎盘FTO基因在小于孕龄儿组、合并GDM正常体重组、合并GDM巨大儿组三组的基因表达明显增加，且差异具有统计学意义。见表1，图1、图2。
表1 胎盘FTO基因在各组中的表达情况[例(%)]
注：和正常体重组相比，*P<0.05
讨论
1.FTO基因的结构及功能：FTO基因是新近发现的一个与肥胖及代谢综合征有关的高度保守的基因。2007年，Frayling等[1]在寻找II型糖尿病致病基因的过程中发现了它，并证实其真正作用是参与肥胖的发生、发展。FTO基因突变会导致人类体重指数(BMI)的增加[6]，而FTO基因失活则表现为脂肪组织和体重指数的减少[7]。FTO基因产物在蛋白结构上与Fe(II)-2-酮戊二酸依赖的核酸去甲基化酶有同源性，而该酶参与DNA修复，脂肪酸代谢以及翻译后修饰过程，因此推测FTO基因通过调节细胞质内2-酮戊二酸的浓度来调节能量的代谢[8]。近年来更进一步的研究表明，FTO基因更多的是调控摄食习惯，而并不是先前所认为的能量代谢[9]。FTO突变基因的携带者更喜爱食用高能量的食物，并且需要不断进食来抵抗FTO基因突变带来的饥饿感，最终导致肥胖的发生[10]。
近年来，国际上提出“健康与疾病的发展起源学说”(Developmental Origins of Health and Disease,DOHaD学说)，该理论基于对荷兰饥荒时期的孕妇营养状况研究，发现孕期营养缺乏对后代某些代谢性疾病的发生起重要影响[11]。大量动物实验及临床研究结果表明，胎儿宫内发育过程中遗传因素与宫内环境因素共同影响，引起胎儿生长发育异常，并导致其成年后某些疾病的发生[12]。因此，笔者提出假设，胎儿期FTO基因的表达的差异能够影响新生儿出生体重，进而影响成年后肥胖的发生。最近的研究提出，在对GDM患者的基因组研究中观察到其FTO基因的高表达[13]，且有相关统计数据显示，GDM患者中巨大胎儿的发生率高达25%～40%[5]。可见孕期合并GDM是影响新生儿出生体重的因素之一。
2.FTO基因与出生体重：本实验结果观察到在无妊娠期合并症及并发症的产妇胎盘中，小于孕龄儿组胎盘中FTO基因表达明显增加，且与正常出生体重儿组相比差异有统计学意义。这可能是由于FTO基因通过调控胎儿宫内能量代谢，引起构成出生体重的成分比例异常，导致低出生体重儿的发生。这种新生儿期的低体重引起的比例异常，在儿童期会出现体重增长的“反跳”现象[14]。而研究表明，低出生体重儿在成年后出现肥胖及代谢性疾病的风险增加，尤其在出现出生后加速生长的情况时风险更高[15]。低出生体重儿1岁以内低体重而其后迅速生长的生长模式与成年后肥胖及一系列代谢性疾病有密切关系[16]。一些在青春期前的体脂含量高于同年龄对照组，并且出生后加速生长的低出生体重儿在儿童期体重指数增长预示着更高的心血管疾病的发病风险[17-18]。最新的研究也显示，早产的低出生体重儿，肥胖和代谢性疾病发生的风险增加[19]。因此笔者推测小于孕龄儿在成年后发生肥胖及代谢性疾病的可能性较正常出生体重儿有增加风险。不过一些全基因组的研究和荟萃分析的结果指出，成年后肥胖及代谢性疾病的出现是基因和环境共同作用的结果，FTO基因的表达对预测成年后发生肥胖及代谢性疾病的可靠性尚不能确定[20-21]。更有一些研究表示，目前尚无证据显示FTO基因的突变与胎儿宫内生长发育及新生儿出生体重有直接关系[22]。
本实验发现相比较正常出生体重儿组，无妊娠期合并症及并发症的巨大儿组胎盘中FTO基因的表达未见明显增加，两组差异无统计学意义。原因可能是实验所选取的胎盘组织来源于无任何合并症及并发症的、完全健康的产妇。这些新生儿体重超过4 000 g的原因可能来自种族、遗传因素或孕期营养良好等，并非胎儿能量代谢异常导致体重增加，这类巨大儿应该被叫做“健康巨大儿”。印度的一项研究指出，出生体重中脂肪含量是与代谢最相关的因素，且胎儿的出生体重是遗传因素与宫内环境共同作用的结果[23]。仅凭此指标并不能反映出胎儿宫内生长发育中出现的不利因素的发生时间以及表现形式，也不能正确反映胎儿出生时身体中脂肪含量的多少。这可能是本实验中选取的此类“健康巨大儿”组胎盘中FTO基因的表达与正常出生体重儿组差异无统计学意义的原因。
3.FTO基因与GDM：GDM的孕妇远期将有17%～63%并发II型糖尿病[5]。而II型糖尿病的发生与肥胖，体重指数增加等等关系密切。早期研究者们认为FTO基因与II型糖尿病间的关系是其同肥胖之间关系的延伸，但进一步研究发现，FTO基因可能与II型糖尿病间的发生有直接关系。最近一项针对东南亚的96 551名个体的大样本荟萃分析结果证实FTO基因是II型糖尿病的独立风险基因[24]。而临床上大部分妊娠期糖尿病患者表现出肥胖，胰岛素抵抗以及相对性胰岛素分泌受损，这与II型糖尿病的病理生理十分相似[25]。最近也有研究提出，FTO基因与早发性肥胖、II型糖尿病、高血压等代谢性疾病的发生关系密切[26]，FTO基因的高表达是GDM后并发II型糖尿病的危险因素之一[27]。
本实验观察到合并GDM的正常出生体重儿胎盘中FTO基因表达明显高于无妊娠期合并症及并发症的正常出生体重儿，且在合并GDM的巨大儿胎盘中的表达亦明显增高，提示胎盘FTO基因的表达在合并GDM的孕妇中呈增加趋势。而且，笔者发现，尽管无妊娠期合并症及并发症的巨大儿组胎盘中FTO基因的表达与正常出生体重儿组相比差异无统计学意义，但其表达却低于合并GDM的巨大儿组，差异具有统计学意义。这更加印证了FTO基因与妊娠期糖尿病之间的关系。推测胎盘FTO基因可能通过调节胰岛素敏感性、胰岛素抵抗及反馈调节控制糖异生来调节体内糖类的代谢，导致糖代谢异常。并且有文献证实该基因的表达情况能够反映体内糖类代谢的水平[6,28-29]。有研究发现，合并GDM的孕妇或是肥胖的孕妇，其后代发生肥胖、胰岛素抵抗、心血管疾病、GDM、 II型糖尿病等疾病的几率也将大大增加[30]。因此，笔者推测孕期合并GDM的产妇所产后代中，无论新生儿是否为巨大儿，其后发生肥胖及代谢性疾病的可能性均增加。
4.结论：胎盘FTO 基因在小于孕龄儿组、合并GDM的正常出生体重儿组及合并GDM的巨大儿组胎盘中表达明显高于正常出生体重儿组。
(图1、图2见封底)
参考文献
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