子宫颈癌是一种恶性妇科肿瘤，对世界妇女健康构成威胁[1]。我国每年新确诊宫颈癌患者约13万人，因宫颈癌死亡约5万人[2]。新疆是我国宫颈癌高发区之一，本地区维吾尔族妇女宫颈癌发病率居全国首位(17.27/10万)[3]，患病率显著高于同地区汉族妇女3～4倍，新疆地区宫颈癌的患病率为459/10万～590/10万，也明显高于我国其他省区[4]，维吾尔族宫颈癌的病死率(15.78/10万)在全国少数民族中排在首位[5]。
高危型人乳头瘤病毒(HPV)持续感染是宫颈癌发生的首要因素。根据病毒毒力及能够导致宫颈癌的致癌程度，可将HPV划分为3类，致癌能力强的高危型HPV(high risk HPV，HR-HPV)、中等程度的可能高危型HPV及致癌能力弱的低危型人HPV(low risk HPV，LR-HPV)。HR-HPV包括HPV16、18、31、33、35、39型等；可能高危型HPV包括HPV26、53和66型；低危型人乳头瘤病毒HPV包括HPV6、11、40、42、43等型别。现有研究表明，HPV16和HPV18与70%的宫颈浸润癌有关[6]。COBAS 4800 HPV基因型检测是一种通过实时荧光定量法扩增检测高危型HPV DNA的检测技术，能够检测出HPV16、18及其他12种高危HPV型别。新疆地区维吾尔族妇女HPV感染率低，但宫颈癌的病死率及患病率居高不下，已经引起众多学者的关注及研究。高危型HPV基因型检测在国内经济发达地区已经作为宫颈癌的初筛检测技术，能否在新疆地区进行推广应用值得探讨。通过总结研究适合我区的宫颈癌筛查、分流管理方案，为新疆地区宫颈癌防治工作提供一定科学依据。
对象与方法
一、对象
选取2014年9月—2015年8月在新疆维吾尔自治区人民医院门诊和病房自愿行宫颈癌筛查并有宫颈组织病理检查结果的女性564例，应用第二代反向点杂交捕获法(hybrid capture 2，HC2)和液基薄层细胞检测技术(TCT)进行HPV基因型定性检测及细胞分类学诊断，将入组全部研究对象的宫颈液基剩余脱落细胞进行HR-HPV(COBAS HPV)基因型检测。维吾尔族女性患者278例，平均年龄(45.0±11.0)岁；汉族女性患者286例，平均年龄(45.7±11.8)岁。两组年龄比较，差异无统计学意义。研究对象均在非月经期采样，采样前3天内不用阴道栓剂，前1天起禁止性生活；均无子宫切除、宫颈锥切手术或放疗，化疗等治疗。标本4 ℃冰箱保存，2周内检测完毕。
二、方法
1.阴道镜检查及宫颈活检：按照纳入标准为TBS提示ASC以上和(或)高危型HPV阳性者。对入组的研究对象行阴道镜检查，包括醋酸实验和碘实验。宫颈活检的条件为阴道镜下有病变直接取活检；若无可见病变，根据HPV检测和细胞学检测结果，与患者沟通征得同意后取活检，通常在宫颈3、6、9、12点随机活检。由病理科专业医生阅片判读，将病理诊断结果作为诊断实验的金标准。
2.HC2 HPV DNA基因分型检测(第二代反向点杂交捕获技术)：用Digene公司圆锥形采样刷，采集宫颈脱落细胞放在Digene样本保存液中储存。按照Digene公司提供的专用检测试剂盒说明进行，裂解、杂交、捕获、冲洗、收集信号、判读。检测样本中13种HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68的DNA含量，单位为RLU/CO。HPV的结果以RLU/CO比值≥1.0界定为阳性，RLU/CO比值<1.0界定为阴性。
3.宫颈液基薄层细胞学检查(TCT)：细胞学专用采样刷收集全部研究对象宫颈脱落细胞，各病例标本等分成2份，其中1份采用超薄液基细胞检测系统，制成单层细胞涂片。由2名妇科细胞病理学专业医生严格执行双阅片，采用2001年国际癌症协会推荐的新TBS分级系统进行细胞学诊断标准判读，判断结果一致予以签发报告，如不一致，提交副主任医师以上高职病理诊断医师予以判断进行报告签发。细胞学结果分为宫颈上皮内病变阴性，包括良性反应性细胞改变(NILM)；宫颈未明确诊断意义的非典型鳞状上皮细胞(ASC包括ASC-US、ASC-H)；低级别宫颈鳞状上皮内病变(LSIL)；高级别宫颈鳞状上皮内病变(HSIL)；宫颈鳞状细胞癌(SCC)；未明确诊断意义的非典型腺细胞(AGUS)和腺癌(ACC)。
4.COBAS HPV基因型检测HR-HPV基因分型检测实验：COBAS HPV测试是以2个主要的过程为基础。(1)同时提取HPV和细胞的DNA自动化的样本制备；(2)运用HPV和β-球蛋白特异性的引物及分开荧光标记HPV和β-球蛋白特异性的寡聚核苷酸检测探针的实时荧光PCR扩增。β-球蛋白作为内部质控，通过检测β-球蛋白判定样本DNA是否符合检测要求。COBAS HPV测试中对β-球蛋白的共同提取，扩增和监测，监视了整个测试过程。
将液基细胞学采样刷收集的第2份宫颈脱落细胞，按照COBAS HPV系统的操作手册进行细胞HPV DNA的自动化样本制备及PCR扩增和荧光检测，12种高危HPV亚型(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68)用同一种荧光染料监测，然而HPV16、HPV18和β-球蛋白信号分别用不同颜色的荧光染料分别进行监测。通过监测实时荧光信号分别确定样本中感染的HPV型别。
5.统计学处理：应用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计数资料结果的描述采用绝对数和构成比，以病理诊断为金标准对宫颈癌筛查不同检测方法进行诊断实验，对灵敏度、特异度及不同分级HPV感染率列联表资料分析均采用χ2检验，不符合条件的采用Fisher精确概率检验。P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、各检测方法的检查结果
妇女中HC2阳性473例，阳性率为83.9%(473/564)；阴性91例，阴性率为16.1%(91/564)。COBAS HPV 检测出14种HR-HPV感染为阳性，阳性率为64.2%(362/564))；未检出HPV感染为阴性，阴性率为35.8%(202/564)。TCT：NILM 217例(38.5%，217/564)；阳性347例(61.5%，347/564)，其中ASCUS 270例(47.9%)、LSIL 41例(7.3%)、HSIL 36例(6.4%)。因CIN 2及以上组织病理诊断的患者在临床上需要进一步治疗，CIN1及慢性宫颈炎患者可随访，故本研究将CIN2及以上患者视为病理结果为阳性，以CIN2+表示；CIN1及慢性宫颈炎视为病理结果为阴性，以CIN2-表示。本组病理组织为CIN2+为125例。HC2、COBAS HPV、TCT检查结果与病理诊断比较见表1。
表1 HC2、COBAS HPV、TCT检查结果与病理诊断比较(例)
二、各种检测方法的评价
HC2诊断的灵敏度为94.4%(118/125)，特异度为19.1%(84/439)；TCT诊断的灵敏度为54.4%(68/125)，特异度为36.4%(160/439)；COBAS HPV诊断的灵敏度为88.0%(110/125)，特异度为42.6%(187/439)。3种检测方法在灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及漏诊率、误诊率、总符合率见表2，3种筛查方法各评价指标比较，差异有统计学意义。
表2 各种检测方法的诊断效果比较(%)
三、不同液基细胞学分级中高危型HPV感染情况
宫颈上皮内病变阴性，包括良性反应性细胞改变(NILM)217例，其中HR-HPV感染110例；宫颈未明确诊断意义的非典型鳞状上皮细胞(ASCUS)270例，HR-HPV感染183例；低级别宫颈鳞状上皮内病变(LSIL)41例，HR-HPV感染为37例；高级别宫颈鳞状上皮内病变(HSIL)36例，HR-HPV感染32例；无宫颈鳞状细胞癌(SCC)。不同液基细胞学分级中HR-HPV感染率不同，随液基细胞学诊断级别上升HR-HPV感染率有上升趋势，差异有统计学意义。362例HR-HPV感染中单纯HPV16型129例(129/362，35.64%)；HPV18型7例(7/362，1.9%)；合并感染63例(63/362，17.4%)，其中HPV16型合并感染62例(62/63，98.4%)。单纯HPV16型及合并HPV16型感染合计191例(191/362，52.78%)，其他12种高危型感染163例(163/362，45.0%)。随宫颈液基细胞学诊断级别升高，HPV16的感染比率有上升趋势，见表3。
表3 不同液基细胞学分级中高危型HPV感染情况[例(%)]
注：χ2=40.37，P<0.05
四、不同组织病理分级中高危型HPV感染情况
根据组织病理结果分为5组分别为炎症、CIN 1、CIN 2、CIN 3、SCC，经过COBAS HPV检测出HR-HPV在各组中的阳性率分别炎症56.4%(220/390)、CIN1 65.3%(32/49)、CIN 2 86.7%(26/30)、CIN 3 80.0%(40/50)、SCC 97.8%(44/45)。各组之间HR-HPV感染率比较，差异有统计学意义(χ2=44.41，P<0.05)。随病理组织学分级上升HPV感染率逐渐上升。各组间HPV16型感染与非HPV16型感染比较，差异有统计学意义(χ2=40.15，P<0.05)；炎症与CIN 2、CIN 3、SSC比较，CIN 1与CIN 2、CIN 3、SSC比较，差异均有统计学意义，见表4。高危型HPV分型检测出单纯HPV16型感染在各组中的阳性率分别炎症27.9%(109/390)、CIN 1 22.4%(11/49)、CIN 2 53.3%(16/30)、CIN 3 52.0%(26/50)、SCC 64.4%(29/45)，其中癌症组中HPV16型感染最高，其次为CIN 2、CIN 3、炎症组、CIN 1组，差异无统计学意义。
表4 不同组织病理学级别中高危型HPV感染情况[例(%)]
五、HPV16型在维吾尔族及汉族不同病理分级中比较
维吾尔族HPV16型的感染率为41.1%(113/275)明显高于汉族27.0%(78/289)，差异有统计学意义。按照病理组织学分层后，维吾尔族和汉族妇女在炎症中HPV16型感染率比较，差异有统计学意义；在宫颈癌前病变CIN 1、CIN 2、CIN 3及宫颈癌中，维吾尔族和汉族HPV16型感染率比较，差异无统计学意义，见表5。
表5 维吾尔族及汉族妇女中HPV16型感染比较[例(%)]
六、高危型HPV基因型检测与HC2在细胞学ASCUS分流中的比较
对347例细胞学结果为ASCUS及以上的阳性妇女，用高危型HPV基因型检测和HC2检测诊断CIN2+宫颈高级别病变情况比较，发现用高危型HPV基因型检测的灵敏度为98.5%，特异度为33.7%，HC2的灵敏度为97.1%，特异度为14.0%，说明对TCT阳性妇女用高危型HPV基因型检测进行分流优于HC2检测，见表6。
表6 COBAS HPV和HC2在TCT阳性结果中的分流比较(%)
讨 论
宫颈癌在发展中国家，是危害女性健康常见的恶性肿瘤之一。近些年来发现，年轻的的新发病例增多[7]。据预测到2030年，全球范围内新发的子宫颈癌病例型将增加至85万例[8]，子宫颈癌仍然是一个重要的公共卫生问题。
根据2004年和2005年全国性的死亡原因调查显示，中西部地区的宫颈癌患者占绝大多数。2006年在全国范围内进行了第3次居民死亡原因抽样调查，在一百多个样本地区中，子宫颈癌死亡率处于前3位的就有新疆南疆地区莎车县。新疆作为中国宫颈癌高发地区之一，新疆维吾尔族宫颈癌患病率在全国排名第一。宫颈癌筛查作为宫颈癌预防的重要措施，可有效地降低其发病率和病死率。以细胞学及HPV检测方法为主的子宫颈癌筛查已经显著降低了子宫颈癌的发病率和死亡率。
一、液基细胞学在宫颈癌筛查中应用
ASCUS成为临床上处理比较棘手的问题[9]。多数研究认为，ASCUS中经过病理诊断后包含了由炎症、HPV感染、宫颈癌前病变及宫颈癌等不同组织学改变。宫颈癌及癌前病变发生的必要条件高危型HPV持续感染，大量研究提出了针对ASCUS具体有效处理方法，为对ASCUS患者进行高危型HPV检测，针对病因从疾病源头处理疾病，能够将高危患者及高危妇女从筛查的梯队里筛选出来。本研究564例TCT样本经过COBAS HPV基因型检测HR-HPV感染共计362例，不同液基细胞学分级中HR-HPV感染率不同，差异有统计学意义，随细胞学分级上升，HR-HPV感染率逐步升高。虽然TCT灵敏度及特异度不高，但细胞学联合HPV检测筛查费用较贵，患者难以承受联合检测的高额费用，且HPV检测尚未在新疆广大农牧区及边远地区开展，故在本区经济欠发达的地区及尚无HPV检测方法地区仍可以将TCT作为初筛手段。在本区经济发达地区可以按照WHO建议，对于30岁以上的妇女进行宫颈癌筛查时可以使用HPV检测联合细胞学检测，可以有效改善筛查效率，对结果可疑或阳性者进一步行阴道镜检查必要时行组织病理学检查，明确诊断。
二、HPV检测在宫颈癌筛查中的应用
2008年的诺贝尔生理和医学奖颁发给了提出HPV感染与宫颈癌发病的相关性学说的德国科学家Harald Zur Hausen，从而宫颈癌研究模式由传统发病模式转化为以HPV感染为研究重点的病因学模式，此举具有里程碑的意义[10]。HC2是最早经美国食品药品管理局(FDA)批准HPV检测方法。HC2检测针对的是13种高危型及5种低危型HPV L1进行检测，不能在一次检测中同时检测出HPV具体型别，只能明确是否感染HPV，无法明确判断是否为多重感染及由某一亚型引起的持续感染，不能满足HPV基因亚型流行病学调查研究及对宫颈癌发生和预后进行评估的需要。并且HC2检测特点是其具有高灵敏度、低特异度，故临床实践工作提出需要寻求一种平衡高灵敏度、低特异度的方法，从而更有效地进行宫颈癌筛查。COBAS高危型HPV基因型检测系统由x480全自动样品制备仪以及z480全自动实时聚合酶链反应(PCR)扩增仪组成，首先通过自动化样品制备提取并且纯化HPVDNA，然后通过HPV和β-球蛋白引物用PCR扩增提取纯化好的目标DNA，扩增的目标DNA序列与不同的荧光染料标记过的荧光探针结合，分别是HPV16、HPV18、β-球蛋白及12种高危HPV型(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68)4种探针，通过实时监测荧光信号确定样本中HPV的型别和含量。在一次试验中，能够同时检测14种高危HPV型别。COBAS HPV将高危型中的16、18单独进行检测，能够很好地提高筛查效率[11-12]。本研究首次使用COBAS HPV基因型检测对新疆地区维吾尔族及汉族进行宫颈癌筛查检测，COBAS HPV检测在宫颈癌筛查诊断CIN2+宫颈病变的阳性预测值和阴性预测值与TCT、HC2检测比较均高于二者，灵敏度和特异度也较高，相应漏诊和误诊发生率较低，在检测中具有较高的效率。本研究所得结果与马庆等[13-14]对1 031例门诊行宫颈癌筛查妇女进行高危型HPV检测所得的结果基本一致。
本研究COBAS HPV基因型检测在液基细胞学不同分级中结果，单纯HPV16型及合并HPV16型感染合计为191例(52.76%)，超过了半数，考虑HPV16型在本区属于常见的高危型别。其他12种高危型感染为163例(45.0%)。HPV16型在ASCUS、LSIL、HSIL的阳性率分别为27.04%、36.58%、47.22%，其他12种高危型在ASCUS、LSIL、HSIL的阳性率分别为26.30%、31.71%%、27.78%，在随宫颈液基细胞学诊断级别升高，HPV16的感染比率有上升。
不同病理组织分级中HR-HPV感染率随病理组织学分级上升HPV感染率逐渐上升，更好地说明宫颈病变及宫颈癌的发生与HR-HPV有关。高危型HPV检测在组织病理学分级，各组间HPV16型与非HPV16型比较有差异，说明各级病变中HPV16的分布上有差异，但炎症与CIN1、CIN2与CIN3、CIN2与SCC、CIN3与SCC组HPV16型与非HPV16型无差异。COBAS HPV检测出单纯HPV16型及合并HPV16型感染例数在各级别病变中所占比例不同，其中癌症组中HPV16型感染最高为42.2%，其次为CIN2、CIN3、炎症组、CIN1组，约80%女性在一生中感染过HPV，且大多为一过性感染，但仅一小部分进展为宫颈病变，HPV16型感染更易导致病变进展及癌变发生。
三、HPV16型在维吾尔族及汉族不同病理分级比较
国内外大量研究数据显示，HPV16型具有最强的致癌性[15]。新疆作为宫颈癌高发区，其中维吾尔族HPV感染率低，但发病率及死亡率高。本研究对入组汉族和维吾尔族经COBAS高危型HPV基因型检测检出HPV16型结果进行比较，发现在HPV16型别感染中维吾尔族的感染率明显高于汉族，在非HPV16型别中汉族明显高于维吾尔族，两者之间比较有差异。本研究按照病理组织学分层后，维吾尔族和汉族妇女在炎症组HPV16型感染率有差异，说明在炎症组妇女中感染中非HPV16型所占比例高于HPV16型。而在各级宫颈癌前病变及宫颈癌各组间HPV16型感染率无差异，说明在宫颈癌前各级病变及宫颈癌中HPV16型感染在维吾尔族妇女及汉族妇女的分布上无差别。HPV16型在两个民族均为常见的类型，且均随着宫颈病变级别升级感染率增加，说明在2个民族宫颈癌前病变及宫颈癌的发生、发展上HPV16型均为主要感染的高危型别。此结果与亚力坤·穆罕默德[16]研究结果相同，本研究结果很好地印证了HPV16型致癌性强，因此临床工作中要对HPV16型感染高度警惕，对检测发现HPV16型感染要给与积极处理，治疗后严密随访，避免持续感染。对HC2阳性，细胞学结果异常的妇女，行高危型HPV分型检测，是一种有效分流手段，避免漏诊及过度治疗。
四、高危型HPV基因型检测在ASCUS分流中的应用
本研究就细胞学结果诊断为ASCUS及以上347例阳性妇女，进行高危型HPV基因型检测得出的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值均高于HC2检测的结果。本研究中的灵敏度、阴性预测值与国内国外查阅的大量文献报道相一致[17-19]，均达到90%以上。本研究中的特异度低于文献报道结果，考虑与本研究中入组对象来自于医院，并非来自大规模筛查人群的原因有关。高危型HPV基因型检测具有较高的效率能够很好地分流ASCUS患者，可以在宫颈癌筛查分流管理应用。
综上所述，高危型HPV基因型检测可在本区进行大规模筛查应用，在应用中不断积累经验从而寻求一种适合我区宫颈癌筛查、分流的技术方案。
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